贵州枇杷炭疽病病原菌的鉴定及rDNA-ITS序列分析

李小霞，肖仲久，章同平

(遵义师范学院生物系，贵州遵义 563002)

枇杷 Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.属蔷薇科Rosaceae苹果亚科的一个属，是我国重要的亚热带经济作物，果实味道鲜美，叶因含苦杏仁甙和挥发油具有镇咳、祛痰、平喘等作用;种子可酿酒及提炼酒精;木材质地坚韧，可制木梳、木捧等，经济价值很高［1］，种植面积逐年扩大。枇杷从种植、采收到果实的贮存整个过程中都会受到各种病害的危害，叶片、果实、苗木等都会受到侵染，仅真菌性病害就达20余种［2-4］。其中，炭疽病是枇杷生产中危害较重的病害之一，全世界各枇杷种植地均有报道。该病害主要危害枇杷叶和果实，常造成苗圃大量苗木死亡，也会造成果实腐烂落果，枇杷果实贮运期间还会继续发病，引致经济损失。

炭疽病也是贵州枇杷苗木生产中发生严重的病害，在生长期呈暴发趋势，严重影响苗木的品质。

在此之前贵州尚未发现枇杷炭疽病，对贵州枇杷炭疽病的病原菌种类不清楚，国内其它枇杷产区报道较多的是对该病病原菌的生物学特性研究及室内抑菌实验等。为弄清该病害致病菌的归属，有效地开展防治工作，笔者在对贵州枇杷炭疽病调查的基础上，采用传统的形态学方法并结合病原菌rDNA-ITS序列分析进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 病害调查和症状观察 2009—2010年调查贵州遵义市郊、黔南罗甸枇杷苗圃基地炭疽病的发生和危害情况，对枇杷病叶的症状观察、记载和拍照。

1.2 病原菌的鉴定

1.2.1 病原菌的分离和纯化 采用常规组织分离法［5］。把病原菌接种在PSA培养基上，25℃恒温培养，待分生孢子产生后，挑入灭菌蒸馏水中，配成浓度约为1.0×106个/mL的孢子悬浮液，用无菌毛细管吸取少量孢子液，轻轻点在PSA培养基平板上(培养基平板预先用直径5 mm的打孔器打孔作好标记)，待分生孢子萌发后，形成微小菌落时，显微镜下将由单个分生孢子萌发形成的微小菌落切下，接入新的PSA平板上，以获得单孢纯菌株。

1.2.2 致病性鉴定 以病原菌的菌碟作为接种体，选择健康的枇杷叶片进行离体接种。供试叶片先用75%酒精进行表面消毒，再进行伤口接种(刺伤)，叶脉另一侧接种直径为5 mm无菌的PSA培养基做对照，接种后保湿24 h，每隔1或2 d观察症状。发病后再次分离病原菌，并与原接种菌进行比较［6］。

1.2.3 病原菌形态学的特征观察 将病原菌移接于PSA平板上，25℃培养3～4 d，记录菌落特征，并在显微镜下观察分生孢子和附着胞。

1.2.4 分子鉴定

1.2.4.1 DNA提取 将已纯化的病原菌移至PSA液体培养基中培养，25℃培养4 d。将培养好的菌丝在双层尼龙网上过滤，并用无菌水冲洗2～3次，用滤纸压干后置于-20℃冰箱中保存备用，DNA提取采用常规 CTAB 法［7］。

1.2.4.2 rDNA-ITS的扩增 采用真菌ITS通用引物ITS1和 ITS4［8］进行扩增。PCR反应体系为25 μL，各组分如下:模板 DNA 1 μL(约 30 ng)，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，引物 ITS1 和ITS4 各 0.5 μL(10 μmoL/L)，TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 17 μL，所用试剂除引物外，均购自Tiangen生化科技有限公司。

PCR扩增在PTC-200型扩增仪上完成，扩增程序为:94℃，预变性3 min，然后94℃，1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35次循环，72℃延伸8 min，4℃保存。反应结束后，取5 μL扩增产物，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像系统(Bio-Rad公司)观察、照相、保存。在紫外灯下从凝胶中切取目的条带，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(TaKaRa)纯化，送北京诺赛基因测序。

然后将菌株的rDNA-ITS序列与GenBank数据库中已知序列进行序列比对，并进行同源性分析，结合病原菌的形态学观察及致病性测定，最终确定病原菌的种类。

2 结果与分析

2.1 病害症状 枇杷炭疽病在贵州各地苗圃基地均有发生，发病严重的田块病叶率25%左右，5—9月是发生高峰期，严重的可造成叶片大量枯死或脱落。该病主要危害枇杷的叶片及叶柄(因是苗木，尚未开始结果)。发病初期，病斑呈水渍状小斑点，后扩展成直径3～7 mm的近圆形、椭圆形或不规则形病斑，病斑中部浅褐色至灰白色，边缘黑褐色，偶尔会出现不规则的同心轮纹，病斑后期可相互连结成片;叶柄染病，多发生在叶柄与叶片交界处，初为暗绿色小点，后发展成不规则长条形病斑，颜色呈褐色至黑褐色，后期病部常密生小黑点，即病原菌的分生孢子盘(图1)。

图1 枇杷炭疽病自然发病症状

2.2 致病性 将11个已纯化的菌株接种到健康的枇杷叶上，5 d后，接种部位出现水渍状的褐色病斑，10 d后出现典型的炭疽病症状(图2)。对病斑进行再次常规分离，获得了与原分离菌相同的病原菌。因此，按照柯赫氏法则可证明，接种菌即为枇杷炭疽病的病原菌。

图2 枇杷炭疽病菌接种叶片10 d后表现

2.3 病原菌的形态特征

2.3.1 病原菌的培养性状 分离纯化获得的11个菌株形态特征基本一致。在PSA培养基平板上25℃ 培养，菌落呈圆形，菌丝灰白色、绒毛状，边缘整齐。在显微镜下观察，菌丝无色，具有隔膜和分枝。菌落正面灰白色，背面橘黄色，即病原菌的分生孢子团(图3)，分生孢子圆筒形或长椭圆形，有时一端稍小，单胞无色，具有一个油球，孢子大小(10.5～21.3)μm×(4.0～6.75)μm。分生孢子萌发产生的附着胞，近圆形、椭圆形或不规则形。在自然条件下及人工培养基上未发现有性型(图4)。

图3 PSA培养基上病菌菌落(正面)

图4 分生孢子和附着胞;标尺=10 μm

获得的11个病原菌株的形态学鉴定结果较一致，这表明，侵染贵州枇杷的炭疽病菌组成单一。参照陆家云［6］、Sutton［9］等的描述，初步确定，贵州枇杷炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz.。

2.4 分子鉴定

2.4.1 rDNA ITS区段扩增及测序 为进一步确认贵州枇杷炭疽病菌的归属，克隆并分析了分离纯化的11个菌株的rDNA-ITS序列。11个供试菌株的PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，均扩增得到一条分子量介于500～600 bp的条带(图5)。将菌株PCR产物回收纯化，经测序分析，该片段全长约540 bp。对11个供试菌株的rDNA-ITS序列进行比较分析，表明除8号菌株外(与其它菌株相比，存在2个碱基的差异，可能属于测序误差)，其它10个菌株的序列完全一致。

2.4.2 rDNA-ITS序列的Blast比对与亲缘关系分析 在NCBI网站上进行同源性BLAST比较，发现与供试菌株(包括8号菌株)同源性达99%及以上的均为胶孢炭疽菌或胶孢炭疽菌的有性型围小丛壳Glomerella cingulata(代表菌株 GX 02登录号:JN704145)，与分离自我国山东的一株核桃炭疽菌株(登录号:HQ845105)的rDNA-ITS序列同源性最高。因此，根据rDNA-ITS序列比对分析，结合形态学特征，可以确定该病害为炭疽病，病原菌种类为胶孢炭疽菌，其有性型为围小丛壳。

图5 PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(M:100bp DNA Ladder)

3 结论与讨论

由胶孢炭疽菌引起的植物炭疽病是世界性的植物病害，尤其在热带、亚热带地区，寄主范围十分广泛，能够侵染多种植物，引起多种经济作物减产和品质下降［10-11］。

炭疽菌的常规鉴定主要以分生孢子和附着胞的形态特征为主，菌落培养特征和寄主范围作参考的综合特征来确定的。但是，在植物炭疽菌属中，许多种类的分生孢子和附着胞的大小、形态都较相似，进行炭疽菌种类的准确鉴定通常较难。根据形态学特征来进行炭疽菌种类的鉴定和分类是不完善的［12-14］，尚需借助辅助技术手段。目前，存在高度保守区和可变区的真菌rDNA被认为是真菌分子研究方法的理想部位。尤其是真菌核糖体内转录间隔区(ITS)，因其进化速率比编码区快，在种内存在高度保守，而在种间存在着极大的变化。这些都可为真菌的分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息［15］。因此，以传统的形态学鉴定为基础，同时结合PCR为辅助的rDNA-ITS分子检测技术，可最大程度的保证鉴定结果的可靠性［16］。

植物病害的研究中，病原物的准确鉴定对于病害的防治和流行预测具有十分重要的意义。本研究根据传统的真菌形态学、致病性鉴定及病原菌rDNA-ITS序列的同源性分析结果，最终确认近年在贵州枇杷苗木上暴发的疑似病害是由胶孢炭疽菌引起的炭疽病，病菌的有性型为围小丛壳菌，未发现尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum Simmonds联合致病。这与孔琼等报道的云南蒙自、陶金华 等报道的福建枇杷炭疽病病原菌相同［17-18］，与瞿付娟报道的重庆枇杷炭疽病病原菌不同［19］。这说明，贵州省不同枇杷种植地发生的炭疽病病原菌结构比较单一，病原菌种类相同，这对于病害的防治与抗性品种的选育是十分有利的。

［1］ 韩金声.中国药用植物病害［M］.长春:吉林科学出版社，1990:144-147.

［2］ 戴芳澜.中国真菌总汇［M］.北京:科技出版社，1979:79-100.

［3］ 刘添丁.常见枇杷病虫害及其防治［J］.农药世界，1993(115):23-29.

［4］ 林尤剑，高日霞.福建枇杷病害与综合防治［J］.福建果树，1993(3):58-60.

［5］ 方中达.植病研究方法［M］.北京:中国农业出版社，1998:123-125.

［6］ 陆家云.植物病原真菌学［M］.北京:中国农业出版社，2001:55-56.

［7］ 肖仲久，李小霞，段帅，等.麻疯树叶枯病菌的鉴定［J］.菌物学报，2010，29(6):874-878.

［8］ 肖仲久，李红玫，蒋选利.草石蚕块茎腐烂病病原菌鉴定［J］.植物病理学报，2011，41(2):210-214.

［9］ Sutton B C.The Coelomycetes［M］.England:CM I.，Kew，1980:523-537.

［10］ S Y Yang，S C Su，T Liu，et al.First report of anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides on pistachio(Pistacia vera)in China［J］.Plant Disease，2011，95(10):1314.

［11］ T Thomidis，E Exadaktylou.Occurrence of a fruit spot disease of pomegranates caused by Colletotrichum gloeosporiodes in the Prefecture of Komotini，Greece［J］.Plant Disease，2011，95(7):1287.

［12］ Du M，Schardl C L，Nuckles E M，et al.Using mating-type gene sequences for improved phylogenetic resolution of Collectotrichum species complexes［J］.Mycologia，2005，97(3):641-658.

［13］ Abang M M，Winter S，Green K R，et al.Molecular identification of Colletotrichum gloeosporioides causing yam anthracnose in Nigeria［J］.Plant Pathology，2002，51:63-71.

［14］ Brown A E，Sreenivasaprasad S，Timmer L W.Molecular characterization of slow-growing orange and key lime anthracnose strains of Colletotrichum from Citrus as C．acutatum［J］.Phytopathology，1996，86(5):523-527.

［15］ 林剑伟，阙友雄，陈天生，等.核糖体DNA的内转录间隔区序列标记在真菌分类鉴定中的应用［J］.生物技术通讯，2007，18(2):292-294.

［16］ 吴良庆，朱立武，衡伟，等.砀山梨炭疽病病原鉴定及其抑菌药剂筛选［J］.中国农业科学，2010，43(18):3750-3758.

［17］ 孔琼，袁盛勇，叶海燕，等.云南枇杷炭疽病菌生物学特性研究［J］.西南农业学报，2010，23(4):1380-1383.

［18］ 陶金华，胡瑞兰，陈发河，等.枇杷炭疽病菌的生物学特性的研究［J］.新疆农业科学，2006，43(6):472-476.

［19］ 瞿付娟.重庆枇杷花腐病病因研究［D］.重庆:西南大学，2008:41.