樟子松疱锈病重寄生菌的分离鉴定

邓勋，张素华，宋小双，马晓乾，魏霞

(1.黑龙江省林业科学院森林保护研究所，黑龙江哈尔滨 150040;2.呼和浩特市森林病虫害防治检疫站，内蒙古呼和浩特 010020)

樟子松疱锈病是二针松类枝干上的主要病害，病原为松芍柱锈菌Cronartium flaccidum(Alb.et Schw.)Wint.，疱锈病感染率一般在10%左右，重病林分可达40%左右，对我国林业生态建设造成了严重的威胁［1］。松芍柱锈菌锈孢子传播可侵染转主寄主芍药Paeonia lactiflora Pall.和赤芍P．obovata Maxim.，因此防治困难，并带来一系列的环境问题。众多研究发现，重寄生菌对植物病原菌有着明显的控制作用，是一类极具生防潜力的生物资源［2］，重寄生性也是多数生防菌的主要生防机理。重寄生菌的研究不仅具有理论意义，更有重要的应用价值。本文对松芍柱锈菌重寄生菌进行了分离鉴定，并研究其对锈孢子的作用机理，为进一步研制生防菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料和试剂 于2009年6月上旬在大兴安岭林科所实验基地加格达奇樟子松种子园随机选取樟子松疱锈病发病植株，进行锈孢子和感病枝干的采集。用手术刀片划破锈孢子器，将锈孢子抖入灭菌的三角瓶中，4℃干燥保存;用手锯将锈孢子器较多的感病枝干截成小段，放入牛皮纸袋中，剥取感病枝干树皮放入已灭菌的三角瓶中。

组织DNA提取试剂盒、Taq酶、D2000 Marker购自北京天根生化试剂公司，其它试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 试验方法

1.2.1 重寄生菌的分离鉴定

(1)在锈孢子上的分离:将锈孢子直接抖入PDA平板上，待锈孢子周围长出菌落后，进行分离纯化。

(2)在感病枝干上的分离:将感病枝干和病皮放在恒温培养箱中，25℃、相对湿度80%保湿培养，待锈孢子器表面长出菌丝，锈孢子器变白后，挑取少量菌丝放到PDA平板上，25℃恒温箱中培养，3 d后长出菌落，分离纯化菌落。

(3)菌株鉴定方法:对分离得到的菌株进行统计，查阅相关文献进行形态鉴定，确定分类地位;通过PCR扩增菌株的16S rDNA序列，将PCR产物送至上海生物工程有限公司进行测序，测得的序列在GenBank中进行BLAST比对，进行序列提交，获得基因登录号。

1.2.2 重寄生菌的筛选

(1)菌株接种锈孢子堆 通过对分离的真菌进行寄生能力测定来筛选重寄生菌，具体方法:将放有滤纸的培养皿灭菌，滴入无菌水使其湿润，在滤纸上抖入小堆锈孢子，将分离到的菌株直径5 mm菌饼放到锈孢子堆中，25℃保湿培养，每2 d观察1次，连续观察6 d，以不接入菌块的锈孢子堆作为对照，每处理3次重复。通过锈孢子堆颜色变化和接入菌株的菌落形成情况，判断重寄生能力的高低，筛选重寄生菌，并计算锈孢子活力。

(2)供试菌株的再分离 从接种真菌后的锈孢子堆中挑取少量锈孢子置于PDA平板上，培养5 d后，观察菌落情况，并与原始菌株进行对比，每处理3次重复。

1.2.3 重寄生菌对锈孢子的破坏作用

(1)保湿后感病枝干和病皮锈孢子器的变化将采集得到的感病枝干和病皮进行保湿(相对湿度80%)处理，20 d后，观察锈孢子器变化，并挑取锈孢子在显微镜下观察锈孢子的变化。

(2)重寄生菌对锈孢子的作用观察 通过活体接种在锈孢子堆，显微观察锈孢子的变化，结合重寄生菌的作用机理，分析不同重寄生菌对锈孢子的破坏作用机理。

2 结果分析

2.1 重寄生菌的分离鉴定 从樟子松疱锈病的锈孢子和发病组织中分离得到45株真菌，通过形态鉴定和ITS序列测定，分离真菌属于6属9种，包括链格孢、木霉、镰刀菌、毛霉、茎点霉和球壳菌等，不同属的真菌出现频率存在差异(表1)，优势类群包括链格孢菌、镰刀菌和毛霉菌，多数都属于腐生菌。

2.2 重寄生菌的筛选

2.2.1 通过接种锈孢子堆筛选重寄生菌 选用上述分离到的8株有代表性的真菌进行接种(表1)，其中拟枝孢镰刀菌Fusarium sporotrichioides Sherb.和深绿木霉Trichoderm atroviride重寄生能力最强，在6 d的保湿培养中，菌块可以在孢子堆中生长，并形成明显的菌落。在菌落形成和延伸的过程中，锈孢子堆的颜色会逐渐由鲜黄色变为白色。而其它菌虽有生长，但是不能形成明显的菌落，锈孢子堆的颜色也有变化，仅部分变白。对照在6 d的保湿培养中，颜色变化较小，锈孢子完整，颜色鲜艳，具有活力。在6 d的培养过程中，拟枝孢镰刀菌和深绿木霉对锈孢子的杀伤较大，锈孢子的死亡率在85%以上，初步判断拟枝孢镰刀菌和深绿木霉具有重寄生能力，但需要通过回接来验证。

表1 接种后锈孢子堆颜色变化及锈孢子活力测定

2.2.2 重寄生菌的再分离 在变白的锈孢子堆上进行再分离验证，其中拟枝孢镰刀菌、深绿木霉可以在锈孢子堆中形成明显菌落，并使锈孢子堆变白，锈孢子失活，回接后，也分离得到了原始菌株，进一步验证了对锈孢子的重寄生作用，其他菌株的回接分离不到原始菌株，说明锈孢子在采集过程中会混入杂菌，因此在分离的过程中，由于杂菌的生长，原始菌株的作用不明显。

2.3 重寄生菌对锈孢子的破坏作用 感病枝干和树皮保湿大约20 d后，多数锈孢子器可以被寄生，上面着生白色、褐色等颜色的菌丝体，锈孢子堆由鲜黄色变成白色和浅黄色。挑取少量的锈孢子镜检，发现锈孢子出现了几种变化:内含物浓缩，锈孢子萎缩，变瘪;锈孢子表面的疣脱落，变得透明;锈孢子破碎，失去原有形状。这可能与不同的重寄生菌对樟子松疱锈病锈孢子的寄生作用机理不同所致。

为进一步研究重寄生菌对锈孢子的破坏作用，通过锈孢子堆的接种、对锈孢子显微结构变化观察，结果与病皮和病枝保湿培养后的结果一致，显微结构观察锈孢子的变化也大致相同(图1)。

图1 不同的重寄生菌对锈孢子的破坏作用

非重寄生菌如毛霉，球壳菌等，接种后虽然菌丝也能生长，但是显微观察，锈孢子外形完好，疣没有脱落，排列紧密，细胞液没有外溢;而重寄生菌接种后，锈孢子变化明显，并且表现出几个不同的类型，这与重寄生菌对锈孢子的作用机理有必然的联系。重寄生菌的作用机理主要有:(1)通过分泌抑菌物质如毒素、抗生素等，作用于寄主真菌的细胞质膜和细胞内部结构，影响细胞内的物质及能量代谢，导致其生理失调最终使细胞死亡，胞内物质外泄，为寄生菌生长提供养分。通过观察镰刀菌对锈孢子的作用发现，其菌丝、孢子等并未附着寄生在锈孢子表面，但是却能使锈孢子死亡;显微观察表明，虽然锈孢子外表没有受到明显的破坏，疣状突起多数没有脱落，排列比较整齐，但是由于内含物的消融外泄，导致了锈孢子外壁向内凹陷;(2)重寄生菌通过形成附着胞吸附在锈孢子表面，沿着寄主菌体平行生长或者螺旋生长，通过分泌胞外酶如几丁质酶、葡聚糖酶、纤维素酶等分解细胞壁，穿透菌体吸取营养，最后使锈孢子死亡。木霉接种在锈孢子堆几天后，锈孢子堆变白，显微结构观察发现，木霉产生大量孢子，吸附在锈孢子表面，通过寄生作用获得营养，而锈孢子的疣状突起大量脱落，孢子变得透明，或者孢子破碎，最后死亡，这些都说明不同的重寄生菌对寄主的作用机理不同，相互配合，互不干扰，这与前人研究得出的重寄生菌作用机理结论相同。

3 小结

生物防治是有效控制林木病害的手段，樟子松疱锈病是樟子松的重要病害，由于大面积的发生，造成了较大经济损失，目前的防治主要以剪除病枝、加强检疫等措施为主，没有有效的控制手段。生态系统中各种因素相互制约，从而维持了一个稳定的系统，锈菌的生物防治是利用自然界生物之间的重寄生现象(即一种真菌寄生在另一种真菌上)，来控制有害生物的群体数量，达到抑制病害发生的目的。杨艳红对五针松疱锈病重寄生菌进行了分离鉴定，筛选得到多株重寄生菌，并在实际应用中对茶藨子柱锈菌起到很好的控制作用［3］。

通过分离筛选樟子松疱锈病重寄生菌，实现以菌抑菌的生物防治是有效的控制樟子松疱锈病的手段［4］。在首次报道了澳大利亚的杨树Populus×euroamericana锈病Melampsora larici-populina夏孢子上锈菌重寄生菌极细枝孢 Cladosporium tenuissimum Cooke后［5］，有关锈病重寄生菌陆续报道，研究范围涉及到了寄生菌的分离鉴定、次生代谢产物的作用方式等多个方面［6-8］，并在实际应用中有效控制了锈病的发生［9］。本研究通过分离筛选，得到了2株樟子松疱锈病病原菌的重寄生菌，分别是拟枝孢镰刀菌和深绿木霉。该重寄生菌对锈孢子有几种不同的作用方式，其中拟枝孢镰刀菌通过分泌毒素作用于寄主真菌的细胞质膜和细胞内部结构，杀死寄主，使细胞液外泄，从而提供其生长所需的养分;而深绿木霉通过缠绕寄生在锈孢子上，吸取养分，最后使寄主死亡。重寄生菌的寄生能力必须通过野外防治实验进行检验，本研究仅为进一步研制生防菌提供理论依据。

［1］ 王元章.中国森林病害［M］.北京:中国林业出版社，1984:37-39.

［2］ Hawksworth D L，Kirk P，M Sutton B C，et al.Ainworth and bisby′s dictionary of the fungi:8th edition［M］.Cambridge:CAB International，University Press，1995:5-36.

［3］ 杨艳红，陈玉惠，朱云峰.西南地区茶藨子生柱锈重寄生菌的分离与鉴定［J］.浙江林学院学报，2005，22(4):414-419.

［4］ 赵桂华，管斌，刘国华.林木锈病生物防治的研究进展［J］.江苏农业科学，2010(4):115-116.

［5］ Sharma J K，Heather W A.Antagonism by three species of Cladosporium to three races of Melampsora larici-populina Kleb［J］.Aust For Res，1981，11:283-293.

［6］ 叶利芹，吴小芹，叶建仁.竹叶锈病重寄生现象及重寄生菌鉴定［J］.菌物学报，2011，30(3):414-420.

［7］ 李永艳，敖新宇，陈玉惠.茶藨生柱锈重寄生木霉毒素的基本性质［J］.天津农业科学，2011，17(2):11-15.

［8］ 李永艳，陈玉惠，敖新宇.茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化［J］.东北林业大学学报，2011，39(5):102-104.

［9］ Moricca S，Ragazzi A，Mitchelson K R，et al.Antagonism of the two needle pine stem rust fungi Cronartium flaccidum and Peridermium pini by Cladosporium tenuissimum in vitro and in plant［J］.Phytopathology，2001，91:457-468.