应用胚珠切割及子房透明技术观察无融合生殖甜菜M14胚囊发育

刘丽萍 ，王 艳

（1.黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080；2.农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；3.黑龙江大学农业资源与环境学院，哈尔滨 150080；）

无融合生殖（apomixis）是指通过种子进行繁殖的特殊的无性繁殖方式，产生的子代基因型与亲本精确相同，因此能固定杂种优势，具有重要的应用前景。我们于1988年开始进行栽培甜菜（B.vulgaris）与白花甜菜种间杂交，成功获得了真实杂种，经多次回交，首次在世界上获得带有无融合生殖特性的栽培甜菜带有白花甜菜染色体的甜菜单体附加系系列，并利用显微切割技术（Microdissection）在南开大学生命科学学院已将白花甜菜染色体识别并分离，为进一步克隆无融合生殖基因提供优质材料［1－2]。

被子植物的雌配子体也称胚囊［3]。无融合生殖甜菜M14胚囊位于子房、胚珠多层细胞下的深处，甜菜是厚珠心（6～7层）胚珠［4]，这给研究工作带来很大的难度，致使研究手段受到了很大的限制。胚囊是双受精及胚和胚乳发育的主要场所，因此具有重要的研究价值。申业等［5]对甜菜胚囊形成与发育的研究早有报道，但其传统切片方法的制作过程相当繁冗，工作量较大，并且根据连续切片来建立立体概念也需要相当的耐心与经验。为了寻求简便而富于立体感的观察胚囊的方法，我们在研究观察甜菜胚囊压片法及子房透明术观察无融合生殖甜菜胚囊发育的基础上，直接分离胚珠，并对胚珠进行再次切割和分离，直接保留珠孔端进行制片观察，同时利用发育中的胚囊能产生自发荧光的特点，经水杨酸甲酯（methylsalicylate，即冬青油）整体透明，用荧光显微技术（fluorescence microscopy，FM）观察甜菜胚囊，建立了一种快速简便的分析甜菜胚囊发育的子房透明技术，以便从胚胎学角度整体观察无融合生殖甜菜胚囊发育的变化机制。

1 材料和方法

1.1 材料

无融合生殖甜菜单体附加系M14（Beta vulgaris L.，VV＋1C、2n＝18＋1）是黑龙江大学生命科学学院甜菜课题组经过十多年杂交培育的。试验供试材料：栽培甜菜（Beta vulgaris L.）；非整倍体初级三体PT6（VV＋1C，2n＝18＋1）和带有无融合生殖特性的野生种白花甜菜（Beta corolliflora ZOSS.，CCCC，2n＝4x＝36）1982 年引种于英国皇家植物园。

用PT6作为母本、白花甜菜为父本进行杂交，获得了真实杂种（VVCC，2n＝36），利用PT6回交，获得带有白花甜菜的单体附加系系列，经过细胞学和形态学鉴定表明：共获得9种类型的单体附加系系列，其中M14株系为带有白花甜菜第9号染色体的栽培型（Ⅸ）甜菜单体附加系，表明将带有无融合生殖基因的一条白花甜菜染色体转移到栽培甜菜（PT6）中，使原来只能进行有性生殖的栽培甜菜PT6可以高效表达无融合生殖特性［6]。

1.2 方法

1.2.1 整体透明 取不同发育时期的花序或花蕾［7]。用福尔马林5mL＋丙酸5 mL＋50%乙醇90 mL混合固定液（FPA）或戊二醛（glutaraldehyde）（pH=7.0）固定液固定。在FPA中固定24h。在戊二醛中固定2～4h。之后分别换入70%乙醇，贮存在4℃冰箱中备用。材料固定后用10%浓度差的梯度乙醇系列脱水（每次15～20min），然后经无水乙醇与冬青油（1∶1）混合液处理2次，每次处理1h。再转入冬青油中透明，期间换液3次，前两次每次4 h，最后一次处理1d。

1.2.2 整体染色 分别用苏木精和硼砂洋红对甜菜花序进行整体染色。经试验验证硼砂洋红效果更好。硼砂洋红染色液的配制方法：首先取2～3g洋红粉末加到100mL的4%的硼砂水溶液中，加热，煮沸30min。然后将此液静置3d后用等量的70%乙醇稀释，再静置24h后过滤备用。此液为核染剂。将试验材料分别放在50mL的广口瓶中，用硼砂洋红整体染色4～5d。染色是在SQKC-Ⅲ生物制片快速处理仪中进行的（航空航天部兰州飞控仪器总厂）。染色后用酸酒（100mL的70%乙醇中加入盐酸3～5滴）处理，再用70%乙醇冲洗直到它呈现鲜艳透明的红色（注：因前期的甜菜胚珠太小而以小花蕾进行处理，以免胚珠丢失）。用100%乙醇和盐酸1∶1做解离液。解离时间短，解离程度好掌握。材料软化程度以能压散胚珠细胞为准。解离时间为5～10min，用蒸馏水冲洗2～3次。

1.2.3 胚珠剥离与切割 经过透明及染色后的花序在解剖镜下（x75201225G型）用光滑尖锐的解剖针按从小到大的顺序剥离子房进而分离出胚珠，并对胚珠进行切割，只保留珠孔端大约1/3部分。由于甜菜胚珠非常小，经过处理后易丢失，且处理过后的甜菜花序及胚珠都比较柔嫩，挤压后常发生变形或破碎，为解决这些问题，试验中采用凹载玻片代替普通载玻片。制片时将胚珠置于凹槽中央，进行切割和分离。

在分离切割后留下的试验材料上滴一滴透明剂（乳酚甘油，其配方：乳酸20mL，酚20mL，甘油40mL，蒸馏水20mL）。如果胚珠染色不足，可在透明剂中加少许硼砂洋红染色液利于观察经过透明后的植物细胞。

1.2.4 制片 胚珠透明染色2～3min后。盖上盖玻片进行压片（切勿移动盖片，以免细胞变形）。侧重在已做过标记的珠孔方向轻轻敲击，让细胞分散并使细胞都处在同一平面内，不重叠以便于观察。 用丁香油（clove oil）封片。在OLYMPUS-BX51型荧光显微镜下通过荧光显微镜技术观察和照相。

2 试验结果

在OLYMPUS-BX51型荧光显微镜488nm波长荧光激发下，观察发育中的胚囊显示自发荧光，核仁的荧光十分明亮，细胞质与核质的荧光较弱，液泡无自发荧光。由于甜菜胚囊细胞的核仁比周围胚珠组织细胞的核仁大，相比之下自发荧光使胚囊细胞的核仁十分明显，从而有利于观察和分析。

2.1 不同固定液及染色液的效果

用不同固定液固定的材料，在FM下差异明显。FPA固定的材料虽然能观察到胚囊的构造，但层次不够清晰，核仁的自发荧光较弱。相比之下，4%戊二醛固定的材料能清晰分辨出胚囊内部结构，且层次分明，核仁自发荧光较强，其效果比FPA好。这可能是由于FPA固定液对细胞内自发荧光物质有破坏作用所致。

苏木精和硼砂洋红染色差异明显，硼砂洋红更适合于经过透明之后的试验材料，而苏木精更适于石蜡切片。

经过透明的试验材料，在光镜下观察反差小，用相差镜观察效果好。如染色不足可沿着盖玻片滴加硼砂洋红进行再次染色。此方法对稍大或略成熟的胚珠也适用，而且更利于操作。只是在处理的时间上或长或短略有不同。用解剖镜和普通光学显微镜即可进行分离和观察。一般实验室都可做到。

2.2 甜菜胚囊发育过程的观察

利用上述试验程序，可快速清晰地观察分析无融合生殖甜菜M14胚囊发育的各个阶段。研究表明在胚珠珠孔端，珠心表皮下有一个细胞分化为初生孢原细胞，其平周分裂形成初生周缘细胞和初生造孢细胞，周缘细胞进行多次平周分裂形成厚珠心胚珠，造孢细胞直接发育成大孢子母细胞。其特点是细胞变大、细胞质浓、细胞核大，细胞形状为椭圆形。单核胚囊的核随着发育逐渐由胚囊一端向胚囊中心移动进行第一次有丝分裂，之后向两极移动形成二核胚囊。其形态变得细而长，二核期胚囊的中间部位分化出1个大液泡，将两个子核及胞质分别隔在胚珠珠孔端及合点端。随着胚囊的发育进而形成四核胚囊、八核胚囊。最终发育为成熟胚囊。珠孔处看不到花粉管，胚囊没有发生受精作用。2个退化助细胞的自发荧光很强，这可能是由于胼胝质在退化细胞的细胞壁积累所致。成熟胚囊：可清晰分辨出内部构造，即靠近合点端及珠孔端各有3个核，胚囊中部有2个核。珠孔端3个组成卵器，2个助细胞提前退化。合点端3个形成3个反足细胞。成熟胚囊：半数卵细胞的极性与正常卵细胞相反。卵细胞与次生核不经受精而自行分裂，产生无性胚。表明甜菜单体附加系M14是以二倍孢子体无融合生殖为主要繁殖方式，有性生殖为次要繁殖方式的兼性无融合生殖体。雌配子体发育迟缓且有胚囊败育的情况发生。研究发现正常发育的雌配子体只占总数的1/4，这也验证了无融合生殖甜菜单体附加系M14具有出苗率低和结实率低的特性。

3 讨论

胚囊的结构和功能是植物生殖生物学研究的一个重要方面。到目前为止，先后提出过许多观察胚囊的技术：如Young等报道的适用于禾本科植物的雌蕊透明术、观察甜菜胚囊的压片法、整体解剖、整体透明、酶法分离、染色-透明等技术，石蜡切片是植物胚胎发生研究的基本方法，但存在费时费力等问题。整体透明技术是20世纪70年代发展起来的一项技术［8-10]，与传统切片法及酶法分离等技术相比，此技术的优点是能快速简捷观察植物胚囊，目前在植物胚胎学中已得到广泛应用。整体透明术所使用的透明剂主要是混合透明剂和冬青油透明剂。与混合透明剂相比，冬青油透明效果更佳。不仅可用于胚珠，也可用于子房的透明。我们采用了雌蕊透明术与压片法相结合，制片过程简单快速，可获得富于立体感的三维图像。通过剥取胚珠并对分离出来的胚珠进行再次切割只保留珠孔端。采用胚珠透明术，利用水杨酸甲酯（冬青油）透明，Olympus CH型荧光显微镜观察，获得较好的试验结果。

Christensen等［11]利用发育中的胚囊能产生自发荧光，经苯甲酸苄脂（benzyl benzoate）和苄醇（benzyl alcohol）（2∶1）混合透明剂透明，用荧光显微镜观察胚珠小且无子房壁的拟南芥（Arabidopsis thaliana）胚珠发育获得了很好的效果。在此基础上我们用甜菜子房做材料，分离出胚珠，并以价格便宜易于获得的冬青油代替苯甲酸苄脂和苄醇做透明剂，进行无融合生殖甜菜M14胚囊发育的观察，试验表明这项技术对于甜菜子房及胚珠同样适用。

该项技术具有如下显著优点：（1）程序简单，材料制作仅需固定、脱水、透明、胚珠分离四步即可完成。（2）借助于荧光显微镜，无需复杂的试验过程、较大的工作量及费时费力的传统切片。（3）利用发育中的胚囊产生自发荧光，无需荧光染料染色。（4）通过对胚珠的分离和切割使试验效率大大提高。快速省时省力，材料准备及分析仅需几天即可完成。

利用透明和荧光显微镜技术，用本试验方法在观察分析无融合生殖甜菜胚囊发育过程及胚囊败育情况时虽有快速简便的优点，但也有其不足之处。在FM下，胚囊细胞中的核仁显示明亮的荧光易于观察和分辨，卵细胞结构清晰易于识别，助细胞提前退化，反足细胞仅能从核和已认识的结构做出判断，胚囊细胞及细胞核的结构轮廓不够清晰，较难分辨，若从观察胚囊内部结构细节的清晰度考虑，本实验方法不如传统切片效果，在光镜下观察反差小，适于相差镜观察。因此不适用于研究胚囊发育的结构细节变化。

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[3]杨弘远，周嫦.植物有性生殖实验研究四十年[M].武汉：武汉大学出版社，2001：293-335.

[4]刘丽萍，李荣田，满玉华.一种观察甜菜胚囊的压片法[J].中国糖料，2006（2）：33-34.

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[6]申业，申家恒，郭德栋，等.甜菜单体附加系M14无融合生殖的细胞胚胎学研究[J].西北植物学报，2006，26（5）：975-963.

[7]刘丽萍，满玉华，李荣田.甜菜非整倍体BⅢ杂种胚囊发育的观察[J].中国糖料，2007（4）：13-15.

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