异基因造血干细胞移植中嵌合体的STR-PCR定量检测

喻凤宽，符粤文，周 健，李玉富，张龑莉，房佰俊，谢 宁，魏旭东，宋永平

河南省肿瘤医院血液科 郑州 450003

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo－HSCT)是目前治疗恶性血液病的有效手段之一。移植后供者细胞在受者体内的植入情况(即嵌合体的形成)能够判断移植是否成功。移植后各系细胞并非同时达完全嵌合状态(complete donor chimerism，CDC)，因此动态检测移植后细胞的嵌合状态，观察供者单个核细胞(mononuclear cell，MNC)、CD3+T 细胞、CD15+粒细胞的植入顺序，了解其与造血恢复及疾病转归之间的关系，对判断移植效果、实施早期干预及治疗时机的选择至关重要。目前，PCR扩增短串联重复序列(STR)技术(STR－PCR)已被 IBMTR推荐为 allo－HSCT后定量检测供者细胞嵌合状态的金标准[1]。作者用上述方法对22例allo－HSCT患者嵌合状态进行了连续动态观察，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 22例 allo－HSCT患者为2009年1月至2010年10月在河南省肿瘤医院血液科接受治疗的病例，其中HLA相合同胞间外周血干细胞移植19例，HLA相合非血缘外周血干细胞移植3例;男15例，女7例，年龄6～47岁，中位年龄28岁。病理类型:急性髓系白血病(AML)8例，急性淋巴细胞白血病(ALL)5例，慢性粒细胞白血病(CML)6例，恶性淋巴瘤(ML)2例，再生障碍性贫血(再障)1例。

1.2 治疗方案及造血重建标准 造血重建的标准为白细胞(WBC) ＞2.0 ×109L－1，中性粒细胞(ANC)＞0.5×109L－1和血小板(Plt)＞20×109L－1。从移植0天开始血常规监测，1次/d，造血恢复后改为每周3次至移植后1个月。AML、CML及ML患者采用经典BU/CY清髓性预处理方案，ALL患者采用TBI+CY预处理方案，再障患者预处理方案为Flud+BU+TBI。GVHD预防:同胞移植采用CSA+短程MTX，非血缘移植采用CSA+短程MTX+ATG+骁悉(MMF)的四联方案。

1.3 样本采集、细胞分选及DNA提取 术前采集供者和受者外周血或骨髓2 mL，+7 d、+14 d、+21 d和+28 d分别采集受者骨髓，EDTA抗凝，于采血后24 h内用红细胞裂解液裂解红细胞，提取MNC，进行供受者位点检测。标本采集后行细胞分选。采用EasySepR抗CD3单抗、抗CD15单抗，按试剂盒说明程序进行CD3+T细胞及CD15+粒细胞分选。对得到的MNC、CD3+T细胞、CD15+粒细胞3群细胞进行基因组DNA提取，用紫外分光光度计测定DNA，调整DNA终质量浓度为2 mg/L。

1.4 STR-PCR 对 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、 D3S1358、 TH01、 D13S317、 D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818 和FGA 15个基因位点及1个性别位点AMEL的STR进行PCR扩增，参考文献[2]配制PCR反应体系:扩增1.3中所得的淋巴细胞混合液20 μL+引物混合液 10 μL+Taq 酶 5 U/μL+ 模板 DNA 1 μL(2 ng)。扩增条件:预变性95℃11 min;94℃变性1 min，59℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，28个循环;最后60℃延伸45 min。

1.5 嵌合状态分析 参照文献[3]的方法对STR－PCR产物进行全自动毛细管电泳，并行基因扫描、分析，判读各基因座基因型及进行片段分析。由供受者基因型差异选择嵌合率(DC)计算公式，代入峰下面积值计算各位点的DC，以所有位点DC的平均值[4]表示采用所有信息。当供者细胞完全占据受者的骨髓或外周血，称为完全的供者嵌合状态(CDC，供者细胞＞95%);可以同时检测到供者和受者两种细胞成分，称为混合嵌合状态(MC，供者细胞占2.5% ～95%)。供者细胞＜2.5%为微嵌合体。

2 结果

2.1 移植后造血恢复情况 22例患者在移植后均顺利恢复造血，ANC重建中位时间为+12 d，3例最早+9 d即达重建标准，最晚1例+18 d达重建标准。22例均不需输注血小板，Plt重建中位时间为14 d，最快1例+10 d达重建标准，最晚有2例+21 d达重建标准。

2.2 移植后嵌合体形成情况

2.2.1 骨髓MNC嵌合情况 +7 d时，骨髓MNC的平均供者嵌合率为70%，其中有1例为100%嵌合状态，1例嵌合率最低仅47%，多数患者的嵌合率在60% ～80%。在+14 d，骨髓MNC的嵌合率有1例为88%，1例为92%，其余供者嵌合率均在95%以上。在+21 d和+28 d，骨髓MNC嵌合率均为96% ～100%，达到CDC。

2.2.2 CD15+粒细胞嵌合情况 在 +7 d时CD15+粒细胞的平均嵌合率为40%，最高者为65%，多数患者嵌合率在35% ～55%，其中1例嵌合率最低为22%。在+14 d、+21 d、+28 d嵌合率均＞95%，达到CDC。

2.2.3 CD3+T细胞的嵌合情况 在+7 d，平均嵌合率为65%，最低1例为15%，最高1例达78%，余嵌合率在50%～70%。在+14 d平均嵌合率上升达80%，最高1例为87%。+21 d，平均嵌合率达84%，多数维持在80% ～90%，其中1例达100%。在+28 d，20例达到CDC;2例为88%及90%，在+35 d这2例均达CDC。

1例SAA患者行非血缘外周造血干细胞移植，在+14 d骨髓 MNC检测显示 CDC，在 D8S1179、D21S11、D7S820和CSF1PO位点显示CDC，MNC供者嵌合率100%。

2.3 移植后嵌合体与急性GVHD 22例患者中有8例(36.36%)在造血重建过程中出现急性GVHD，其中3例MNC、CD3+T淋巴细胞、CD15+粒细胞均达CDC，3例仅 CD3+T淋巴细胞达 CDC，1例仅CD15+粒细胞达 CDC，1例 CD3+T淋巴细胞、CD15+粒细胞均达CDC;+21 d 7例患者CD3+T淋巴细胞、CD15+粒细胞的供者嵌合率均＞95%，1例CD3+T淋巴细胞、CD15+粒细胞供者嵌合率分别为82%和88%。发生急性GVHDⅠ－Ⅱ级7例(其中4例单纯表现为皮肤斑丘疹;另2例单纯腹泻，24 h腹泻量＜500 mL/d;1例ALT增高);Ⅲ级1例。

3 讨论

作者通过STR－PCR方法对allo－HSCT移植后嵌合状态进行了动态检测，在移植过程中，对T细胞、粒细胞及全骨髓MNC的植入情况进行了研究，发现在+7 d均可以检测出3类细胞的植入，T细胞的植入率(65%)略高于粒细胞的植入率(40%)，但在+14 d和+21 d以粒细胞的植入为主，T细胞植入略晚于粒细胞，与国内外相关研究[5－7]结果一致。

临床上对移植后的患者常采取外周血和骨髓进行嵌合状态的检测，而全血和全骨髓标本反映的主要是粒细胞的嵌合情况，很可能掩盖了其他系列的嵌合情况[8]。作者观察到移植后MNC供者细胞嵌合率与T淋巴细胞及粒细胞相比早期更高，+7 d即达70%，但随后植入速度与粒细胞基本一致，稍快于T淋巴细胞，可能与MNC中含有各系细胞，供者嵌合率互相干扰有关。

STR位点的等位基因根据供受双方彼此区别的程度可分为3种类型:Ⅰ类(双方均为杂合子且有互不相同的等位基因)、Ⅱ类(一方为纯合且与另一方的2个等位基因之一相同)、Ⅲ类(双方等位基因完全相同)[9]。为保证供者嵌合率计算准确，作者仅选取Ⅰ类位点作为观察指标计算嵌合率，15个STR位点中每个混合样本可检出Ⅰ类位点5～7个。

供者细胞成功植入可以出现造血恢复，通过检测嵌合状态发现，在骨髓抑制阶段，造血恢复期，供者细胞已经开始植入，而后造血恢复。相关研究[10]表明，分子水平植入(ME)即供者细胞嵌合率首次大于50%的时间一般比造血重建早4～7 d。该研究结果显示，中位时间+12 d造血恢复，供者骨髓MNC在+7 d供受者细胞嵌合率达70%，CD3+T淋巴细胞 DC达 65%，与文献[9]报道基本一致。CD15+粒细胞嵌合率为22% ～65%，低于50%，但后期植入迅速，可能与粒细胞植入晚于MNC、CD3+T淋巴细胞有关，也与粒细胞是判断造血恢复的一项指标有关，其在骨髓中增殖成熟即从分裂池到贮备池的生长时间约10～12 d，随后释放入血。该研究结果显示造血恢复中位时间+12 d，与其报道相一致。

供体CD3+T淋巴细胞在急性GVHD的发生中起着最重要的作用。但移植后，供体T细胞植入较慢，受者体内T细胞数目较少，大多处于MC，尽管其MNC及 CD15+粒细胞已达 CDC，仍然急性GVHD发生率低。对于部分CD3+T淋巴细胞达CDC的患者，未出现急性GVHD，推测可能与移植后早期(+28 d内)通过免疫抑制剂的应用，减慢T细胞的植入速度有关，从而避免急性GVHD发生。

总之，随着allo－HSCT研究的不断深入，血细胞嵌合状态的动态监测在早期判断复发、评估淋巴细胞输注的疗效等多方面显得越来越重要，而STRPCR定量检测各细胞系的方法也逐渐被越来越广泛地应用。

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