硫氧还蛋白对缺血再灌注保护机制研究进展1）

王洪志，武小薇，张一娜

急性心肌梗死作为我国发病率、致残率和死亡率三高的疾病，已经成为人类健康的主要杀手。心肌遭受缺血损伤后使用抗凝药物、溶栓药物和早期冠脉介入治疗恢复血流灌注，反而加重心肌损伤，称之为心肌缺血再灌注损伤。1960年，Jennings等［1］首次在犬科动物上发现缺血后再灌注组织损伤加大；1985年，Braunwald和Kloner［2］明确提出了“心肌缺血再灌注损伤”的概念。缺血再灌注损伤机制复杂，涉及能量代谢、多种生物活性分子及细胞内信号转导通路，如再灌注诱发的大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）、细胞内钙超载、线粒体渗透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）开放，炎症和细胞凋亡等，均参与了心肌缺血再灌注损伤，最终加重心肌损伤甚至危及生命［3］。随着对缺血再灌注损伤机制研究的深入，防治策略的研究也有了长足的发展。近年来人们发现一种重要的氧化还原调节蛋白——硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）在缺血再灌注损伤中扮演重要角色。本文就该领域的研究进展做一综述。

1 Trx构成

1964年，Peter Reichard等在大肠杆菌中首次发现硫氧还蛋白，揭开了人们对Trx系统研究的序幕。Trx系统由Trx、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）组成，广泛存在于原核和真核细胞中，在哺乳动物细胞包括心肌细胞也不例外。Trx有五个可修饰的半胱氨酸（封闭圈）。其中的两个，即Cys-32和Cys-35，在催化部位参与Trx酶的活性［4］。含二硫键的Trx通常被称为氧化型Trx（Trx-S2），含巯基的Trx则为还原型 Trx［Trx-（SH）2］，Trx系统的作用主要通过后者来实现，而Trx还原需要通过TrxR来完成［5］。Trx还原作用的机制就在于其与底物X-S2结合后还原蛋白底物。哺乳动物的心肌中包含两个不同的Trx，细胞胞质和细胞核定位的为Trx1，线粒体定位的为Trx2。它们的区别在于半胱氨酸含量：线粒体Trx有两个像细菌蛋白的半胱氨酸残基，而胞质Trx拥有6个半胱氨酸残基［6］。

2 Trx的生物活性

2003年，Yamawaki等证实Trx系统在多种条件下保护细胞免受氧化损伤，在维持生理以及心血管功能中发挥关键作用。Trx系统，作为一个无处不在的巯基氧化还原酶系统，可以通过清除过量氧自由基调控细胞内氧化还原平衡、修复过氧化的巯基蛋白、调节转录因子活性、抑制细胞凋亡、促进细胞生长等方面起着保护心肌的重要作用［7］。

Trx是由应激诱导产生，这些应激包括紫外线辐射，X射线照射，氧化应激和病毒感染诱导，也可以在缺血的组织由再灌注或缺血性预适应诱导。相比之下，Trx1活性对病变组织细胞凋亡显著减少起主要作用。研究表明，Trx在三个方面起作用：调节氧化还原平衡；与各种蛋白质相互作用发挥抗凋亡促生长作用，通过蛋白间的互动，Trx改变酶的活性或接触蛋白的亚细胞定位，从而影响各种细胞功能［4］；调节炎症反应。Trx1在细胞质、细胞核，还有细胞外都起着重要作用。Trx2主要在线粒体内发挥作用。

2.1 细胞质

2.1.1 清除活性氧 氧化应激对缺血再灌注损伤的作用已经得到了共识，能够导致细胞功能受损，脂质过氧化，蛋白质降解，甚至使核酸断裂［8］。心脏是一个耗氧器官，富含线粒体。氧化应激时，线粒体产生ROS，线粒体对ROS是脆弱的，高ROS的进一步损害线粒体，通过ROS诱导ROS产生，从而形成ROS和线粒体功能障碍的恶性循环。ROS也通过抑制离子通道的活性降低心脏泵血功能［4］。ROS在缺血再灌注心肌细胞应激反应影响到几乎所有细胞的调控水平。

研究显示，ROS对细胞不仅仅是破坏性因素，也履行第二信使的功能，能够刺激细胞内的氧化还原缓冲系统启动。心肌细胞死亡或者生存的关键取决于其氧化还原状态，即活性氧与抗氧化剂之间是否失衡［9，10］。在细胞质中，Trx1通过二硫键-巯基的交换反应发挥还原作用，维持细胞内氧化还原平衡。Trx1作为还原剂可直接清除ROS，降低氧自由基的破坏，从而降低DNA损伤以及蛋白质的氧化失活、脂质过氧化［11］。

2.1.2 ASK1 Trx1可以通过抑制凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）发挥抗凋亡功能。ASK1是细胞内的一种重要的促凋亡蛋白，它能通过 MKK3／6和MKK7激活下游两个凋亡激酶：P38MAPK和c-Jun氨基末端激酶（JNK），在细胞因子及应激诱导凋亡过程中起着关键作用［12］。ASK1诱导的细胞凋亡是由线粒体途径介导的，它可能参与对bcl-2家族蛋白的修饰。Trx1可抑制ASK1的活性，上调Bcl-2／bax的比值减少细胞凋亡，从而起到对缺血再灌注损伤保护的作用［13］。在生理条件下，ASK1的活性由几个细胞因子抑制：包括 Trx、glutaredoxin和磷酸丝氨酸结合蛋白［14］。1998年，Saitoh等［15］首次报道了关于Trx1抑制ASK1活性的功能。在生理条件，胞浆中的还原型Trx1同ASK1的N-末端紧密结合，使ASK1处于抑制状态，不激活凋亡程序。体外研究表明Trx1还可以促进泛素化和降解ASK-1［14］。当细胞受到氧化刺激时，Trx1由于氧化而与ASK1分离，使ASK1恢复活性，从而引发下游凋亡事件。再灌注中，活性氧可以进一步氧化产生大量毒性更强的过氧化亚硝酸自由基（ONOO-），而ONOO-可以引起Trx1第49位酪氨酸的硝基化。当Trx1发生硝基化后，不可逆地失去与ASK1结合的能力，ASKl与之分离而活化［11］。

后来发现线粒体Trx2以同样的方式抑制ASK1抗细胞凋亡。Trx1和Trx2共同调节ASK1的凋亡活性，进而调节ASK1诱导的非JNK依赖的凋亡通路。Trx1和Trx2在不同的部位调节ASK1，Trx1与位于细胞浆的ASK1结合，而Trx2与位于线粒体ASK1结合。Trx1还与内皮细胞中ASK1结合调节 ASK1诱导JNK 的激活和凋亡［4，16］。

2.1.3 AKT Trx1已被证明与一种蛋白磷酸酶Phosphatase and Tensin homolog（PTEN）相互作用，激活PI3K和Akt发挥抗凋亡功能。PTEN是PI3K-Akt信号通路的重要抑制因子，在C2脂质结合域有一个关键的半胱氨酸残基，Trx1催化部位的Cys-32与之相互作用形成二硫键。这种相互作用导致催化部位的空间位阻PTEN基因［4］。因此，Trx1-PTEN基因的相互作用，使PTEN磷酸酶活性衰减，导致细胞内重要信号转导通路PI3K-Akt信号通路活化，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase-9、核因子κB（NF-κB）、糖原合成酶激酶-3（GSK-3）、环磷腺苷（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）、FKHR、p21Cip1和p27Kip1等，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用［6］。

2.2 细胞核 Trx1发挥抗凋亡功能，仅仅在细胞液内修饰蛋白是远远不够的，它还在细胞核内转录水平发挥作用，redox factor 1（REF-1）及其下游因子是Trx1作用的重要靶点。氧化还原因子-1（REF-1）是蛋白质的DNA主要的修复因子，它也可作为转录辅激活因子刺激转录因子的DNA结合活性。REF-1是有氧化还原反应敏感Cys残基的蛋白质，必须在还原状态参与转录调控。Trx1作为一个供氢体与REF-1形成稳定的复合物，使之成为对抗氧化应激反应的转导信号，能诱导DNA结合多种氧化还原敏感的转录因子如活化蛋白转录因子（AP-1）、NF-κB、缺氧诱导因子（HIF）-1α、p53和cAMP反应元件结合蛋白，发挥抗凋亡促生长的功能［6，9］。NF-κB和AP-1还是与炎症关系密切的两个转录因子，多种趋化因子［单核细胞趋化蛋白-1（monocyte ehemoattraetant protein-1，MCP-1）］和细胞间黏附分子（VCAM-1）基因启动子区包含有 AP-1和／或 NF-κB的结合位点［17］。

Yodoi研究组最早提出了Trx调控NF-κB转录活性的假说［18］。NF-κB通常与其抑制物IκB蛋白结合成复合物，以非活性形式存在于胞浆中。在胞浆中，Trx发挥抗氧化作用，能抑制活性氧对IκB激酶的激活、IκB的降解和NF-κB的核转位，在胞核中，Trx通过还原效应增强NF-κB与DNA的结合能力，因而促进NF-κB的转录活性。应激诱导Trx向细胞核转位，这时，胞浆Trx的减少解除了对NF-κB的抑制，而核内Trx的增多则促进了NF-κB同DNA的结合。这样，Trx在核内外定向运动使得NF-κB能够接受外界信号，进而调控基因表达。但该机制也受到了一些质疑。Gius研究组发现，AP-1的DNA结合能力和转录活性在稳定表达硫氧还蛋白还原酶的细胞系中显著增强，同时Trx1在这些细胞系中定位于细胞核内，提示Trx1能增强AP-1的活性调节。移位到细胞核，Trx1和APE-1／Ref-1之间相互作用增强AP-1（Jun and Fos）的DNA结合活性，调节AKT介导的抗凋亡信号介导细胞保护［19］。

2.3 细胞外 Trx在应激条件下可分泌到细胞外，并发挥抗凋亡，抗炎活性保护细胞，以及作为自分泌／旁分泌因子促进增长。Trx可能是各种抗氧化剂中唯一具有细胞外功能的蛋白，Trx影响到邻近的细胞，并可能防止损伤扩展［4］。研究发现多种氧化应激相关的病理状态均可发现患者血清中Trx水平明显升高。这种细胞分泌Trx的现象是宿主对氧化应激的防御反应。

Trx1有减弱炎症反应作用，减少人类单核细胞衍生的巨噬细胞，动物试验发现注射外源性Trx1可以抑制白细胞趋化。有体外试验表明，Trx1通过降低白细胞对MCP-1敏感性抑制白细胞趋化。有趣的是，这些结果与经典的升高IL-8的水平阻止炎症部位的白细胞外渗的报告一致。综合二者，Trx1免疫调节作用很可能是由于其类趋化因子活性抑制白细胞聚集［20］。此外，JNK和p38通常与炎症相联系，Trx通过ASK1抑制二者发挥抗炎功能［21］。

其他，Trx1通过AP-1诱导血红素加氧酶-1（HO-1）介导血管内皮生长因子的表达，减少氧化应激［22］。Trx1已被证明是促进HIF-1α的表达和提高活性继而增加VEGF的表达，从而促进血管生长［23，24］。实验发现rhTrx通过激活细胞外信号调节激酶和PI3K，减少的c-Jun N-末端蛋白激酶和p38激活保护Ⅱ型上皮细胞［8］。另外，血管内皮细胞特异性过表达Trx2，可以减少氧化应激和增加一氧化氮（NO）维护内皮细胞的正常功能［8］。

2.4 线粒体 Trx2在调控细胞程序中发挥至关重要的作用，它抑制细胞色素C从线粒体释放，增加线粒体膜电位，抑制Caspase介导的细胞凋亡通路［8］。据认为，功能的变化如线粒体减少膜电位mPTP的形成和线粒体细胞色素C的释放是细胞凋亡重要原因［25］。此外，线粒体是生理情况下呼吸链中和病理情况ROS的主要来源，Trx2可调节线粒体的氧化还原状态，在线粒体介导的细胞凋亡中起重要作用。

3 Trx活性调节

Trx的活性受到多种因素的调节：内源性Trx抑制剂硫氧还蛋白的相互作用蛋白（Txnip）负向调节Trx还原酶的活性；Trx2还受到翻译后修饰调节，既有正性调节也有负性调节。

3.1 TBP-2／TXNIP Nishiyama等最初把Txnip命名为硫氧还蛋白结合蛋白-2（TBP-2），也叫硫氧还蛋白相互作用蛋白或维生素D3-上调蛋白1（VUDP1），在心血管疾病发展中扮演重要角色。TBP-2与脂代谢失调密切相关，可促进动脉粥样硬化和增加冠状动脉疾病的易感性。氧化应激时，过度表达的TBP-2可与Trx结合，结合的Trx失去凋亡抑制功能而使凋亡增加，在细胞水平负性调节Trx1，并抑制NF-κB的DNA结合活性，级联调节细胞的氧化还原、生长、分化、细胞凋亡和衰老［26］。

3.2 翻译后修饰 在生理条件下，细胞凋亡是通过和抗凋亡分子之间的平衡严格控制的。由于多数细胞凋亡涉及的信号分子是蛋白质，这些力量之间的正常平衡仅在基因水平上（转录调控）是不可以被摧毁，还要求在蛋白质水平（翻译后修饰）灭活。最近的研究表明，除了在基因水平上对Trx表达上调或下调外，Trx还对翻译后调节修饰敏感。目前已确定四种形式的翻译后修饰的Trx，这包括修饰发生在半胱氨酸残基的氧化、谷胱甘肽化（glutathionylation）、S-亚硝基化和在酪氨酸残基的蛋白质硝化［14］。

在氧化应激，Trx氧化是最常见的修饰，是半胱氨酸-32和半胱氨酸-35形成二硫键，和／或半胱氨酸-62和半胱氨酸-69间形成二硫键。谷胱甘肽化发生于CYS-73，这种翻译后修饰显著抑制Trx活性。Trx半胱氨酸-69（S-NO）亚-硝化，导致Trx1增强活性，这是唯一增强Trx活性的翻译后修饰。亚硝基化不仅是Trx氧化还原活性的基础，而且还调节Trx的抗凋亡及抗炎活性。Trx酪氨酸-49，由过氧亚硝酸盐硝化 不可逆 的 抑 制 Trx活 性［4，12，14，27］。 因 此，一 氧 化 氮 和 二 次 反应的产品，尤其是过氧化亚硝酸盐，对Trx产生相反的效果。具体来说，一氧化氮本身诱导Trx亚硝基化增强其活性，而过氧化亚硝酸盐硝化Trx导致不可逆失活［4］。NO信号和Trx系统之间的相互作用使心血管系统的氧化还原调控变得更加精细和复杂。

4 小 结

氧化应激诱导Trx介导的一系列抗氧化抗凋亡级联反应，起到保护心肌细胞的作用。内、外源性Trx同样起着心肌保护作用，这为我们减轻心肌缺血再灌注损伤提供了切入点，上调Trx表达及活化修饰将来可能成为抗缺血再灌注的重要手段。

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