新生大鼠缺氧缺血性脑损伤HIF-1α表达与细胞凋亡的关系及干预研究1）

郭晋伟，阴怀清，闫焕利，范泽卫，杜 洪

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）为新生儿期常见疾病之一，是围生期窒息导致脑缺氧缺血性损害，引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一。缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是一种氧敏感转录激活因子［1］。以往研究显示，在轻度缺氧条件下，HIF-1诱导下游靶基因的表达，产生一系列缺氧适应性反应，达到神经保护作用［2］。但是，当神经细胞暴露于慢性或极度缺氧时，HIF-1α的大量表达却促进了细胞凋亡的发生。本研究通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型，观察HIF-1α表达与细胞凋亡的关系及2-甲氧基雌二醇（2ME2）干预后的影响，以期阐明抑制HIF-1α表达后对缺氧缺血性脑损伤的影响及可能的作用，从而为指导临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 一抗：兔抗鼠HIF-1α、caspase-3及二抗：即用型SABC试剂盒和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。2-甲氧基雌二醇系美国Cayman公司提供，由于2ME2是脂溶性粉末物质，采用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，用PBS稀释使有毒物质DMSO的浓度降为5%。

1.2 动物分组及模型制备 清洁级，封闭群，新生7d龄Wistar大鼠120只，雌雄不限，体重10g～15g，购自山西医科大学实验动物中心。采用完全随机设计将大鼠分为假手术组、缺氧缺血组及2ME2干预组。其中后两组又根据HIBD后处死动物的时间（HIBD后3h、6h、12h、1d、2d、3d、7d）随机分为7个亚组，每组各8只。假手术组给予麻醉后切开颈部皮肤，仅分离左侧颈总动脉，不结扎，不予缺氧处理；采用经典Rice法［3］制成HIBD动物模型；缺氧缺血组给予麻醉后切开颈部皮肤，分离结扎左侧颈总动脉后置于缺氧舱中（含8%氧气）2h制作HIBD模型。2ME2干预组于HIBD模型制作后即刻给予2ME2腹腔注射（10μg／g）。

1.3 标本的制备 分别在 HIBD后3h、6h、12h、1d、2d、3d、7d处死各组动物，断头取左侧脑组织，10%多聚甲醛室温固定24h，切块，石蜡包埋后，连续做冠状切片。

1.4 HE染色 常规石蜡切片→二甲苯脱蜡→梯度酒精脱水→苏木素→伊红染色→二甲苯透明→中性树胶封片→显微镜下观察。

1.5 免疫组化

1.5.1 HIF-1α的检测 切片经常规脱蜡后放置至蒸馏水，3%H2O2室温孵育15min，枸橼酸缓冲液高压热休复2min，降温至室温，PBS液洗2min×3次，滴加HIF-1α一抗（1∶200），湿盒置于4℃冰箱中过夜，复温至室温，PBS液洗2min×3次，滴加二抗：抗兔IgG抗体，37℃烤箱孵育15min，PBS液洗2 min×3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A／HRP），37℃烤箱孵育15min，PBS液洗2min×3次，用DAB显色剂显色（镜下观察显色程度），切片放置自来水中终止，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。阴性对照切片用PBS液代替一抗，余步骤相同。

1.5.2 Caspase-3的检测 用Caspase-3的一抗代替HIF-1α的一抗，稀释浓度1∶200，热修复时间1min 45s，其余步骤与HIF-1α的检测相同。阴性对照切片用PBS液代替一抗，余步骤相同。

1.6 图像分析 采用BI-2000医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）进行图像采集与分析，在相同光亮强度和放大倍数（10×40）条件下统计阳性细胞平均灰度值，平均灰度值越高，阳性表达越弱，而平均灰度值越低，阳性表达越强。每只鼠3张片子，每张片子取4个视野，计算其均数进行比较和分析。

1.7 TUNEL法检测细胞凋亡 采用TUNEL法定量观察凋亡细胞，按试剂盒提供的实验步骤进行操作。光镜下观察，胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，即凋亡细胞。高倍镜下（×400）在缺血侧皮质区随机选取10个非重叠视野，计数500个细胞，计算阳性率即凋亡指数（AI），AI=阳性细胞数／观察细胞数×100%。

1.8 统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1 组织病理学观察（HE染色） 假手术组各时间点脑组织结构及细胞层次清晰，细胞排列整齐。HIBD模型组神经细胞水肿，神经元排列紊乱，细胞凋亡增多，胶质细胞增生明显。2ME2干预组各时间点脑组织病理变化较HIBD模型组减轻，神经细胞存活数量多，细胞排列尚规则，层次尚清晰。

2.2 HIF-1α和Caspase-3的免疫组化染色 光镜下观察，HIF-1α和Caspase-3阳性染色呈棕黄色的细颗粒沉积，阳性细胞表达见于大脑皮层和海马，阳性着色在细胞核和细胞质均可见。阴性对照切片中HIF-1α和Caspase-3的免疫反应产物较其他两组明显减少。

2.2.1 HIF-1α的表达 HIF-1α在假手术组各时间点维持低水平表达，在缺氧缺血3h后开始增强，6h逐渐上升，12h达高峰，后逐渐降低，但仍高于正常水平（P＜0.05）。2ME2干预组各时间点HIF-1α的表达水平较HIBD组明显降低（P＜0.05）。详见表1。

表1 HIF-1α在新生大鼠脑组织中的表达（x±s） 平均灰度值

2.2.2 Caspase-3的表达 Caspase-3在假手术组各时间点维持低水平表达，在缺氧缺血3h开始增强，6h～24h逐渐上升，2d达高峰，3d～7d稍有降低，但仍高于正常水平（P＜0.05）。2ME2干预组各时间点Caspase-3的表达水平较HIBD组明显降低（P＜0.05）。详见表2。

表2 Caspase-3在新生大鼠脑组织中的表达（x±s） 平均灰度值

2.3 TUNEL染色凋亡细胞计数 光镜下对假手术组的脑组织皮质部位进行观察，未见明显的凋亡细胞。实验显示缺氧缺血后3h左侧大脑皮质部位即可出现凋亡细胞（凋亡细胞的3种变性形态：细胞皱缩；细胞核固缩，周围有空泡形成；可见核碎片，单个圆形凋亡小体）；缺血缺氧后6h～12h，左侧大脑皮质部位凋亡细胞数明显；1d～7d左侧大脑皮质部位凋亡细胞数逐渐增加，凋亡细胞呈深棕色，且范围广泛。2ME2干预组各时间点凋亡细胞计数较HIBD组明显降低（P＜0.05）。详见表3。

表3 新生鼠脑组织中细胞凋亡指数（x±s）%

3 讨 论

在缺氧的环境中，维持机体的氧平衡是十分重要的。HIF-1是一种氧敏感转录激活因子，是缺氧诱导基因转录的关键环节。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β2个亚基组成的异源二聚体。其中HIF-1α为功能亚基，随着氧浓度的变化对HIF-1起活性调节作用；HIF-1β为结构亚基，不受氧浓度的调节，呈持续表达状态。HIF-1α和HIF-1β形成异二聚体后成为有活性的HIF-1。激活的HIF-1对下游一系列靶基因进行调控，一方面通过促进血管和神经再生、促进EPO生成、改善能量代谢等，对缺氧缺血后的神经细胞产生保护作用；另一方面，HIF-1可以诱导BNIP3和p53的稳定表达而致神经毒性，促进细胞凋亡［4］。

在缺氧时，HIF-1α的表达升高对神经细胞是保护作用还是诱导凋亡作用，目前仍有争议。有文献报道，HIF-1α的表达升高与细胞凋亡呈正相关。研究表明，全脑缺血后海马和皮质区HIF-1α的表达升高伴随着神经元的凋亡和丢失［5］。最近Helton在研究HIF-1α基因敲除小鼠时，发现缺氧缺血状态下相关凋亡基因表达降低，说明HIF-1α表达降低或缺失对神经细胞起到一定的保护作用［6］。本实验研究结果显示，在正常状态下，HIF-1α低水平表达；缺氧缺血时，HIF-1α蛋白表达量增加，同时其下游凋亡因子Caspase-3及TUNEL染色凋亡细胞数也随之增加；2ME2干预后，HIF-1α活性受抑制，蛋白表达量减少，同时也抑制了Caspase-3表达，减少了细胞凋亡。据此推测，HIF-1α过度表达可以诱导细胞凋亡，在整个缺氧缺血性脑损伤的发生、发展过程中起着重要的作用。

HIF-1α抑制剂2ME2是一种天然的雌激素衍生物，可在转录后水平抑制HIF-1α的活性，从而抑制其下游靶基因（如BNIP3、VEGF）的表达，发挥神经保护作用［7］。本实验结果显示，新生大鼠HIBD后，神经细胞出现凋亡与HIF-1α表达增加同步。2ME2可以抑制HIF-1α过度表达，减少神经细胞凋亡，减轻了缺氧缺血造成的脑损伤。由此可见，在缺氧缺血性脑损伤病理生理过程中，HIF-1α过度表达对神经细胞是有害的，HIF-1α的神经保护作用不足以抵抗HIF-1α过度表达造成的诱导细胞凋亡作用。

目前，2ME2的研究主要集中于肿瘤的二期临床治疗［8］。缺氧缺血性脑损伤与肿瘤都具有HIF-1α过度表达这一特点，因此，本实验设计应用2ME2抑制HIF-1α过度表达，进而阐明2ME2在缺氧缺血性脑损伤中发挥神经保护作用。但在2ME2的应用剂量及注射时间的选择上仍处于摸索阶段，有待于进一步研究。

［1］ Goda N，Ryan HE，Khadivi B，et al.Hypoxia-inducible factor 1 alpha is essential for cell cycle arrest during hypoxia［J］.Mol Cell Biol，2003，23（1）：359-369.

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［8］ Susan L.Mechanism of action of 2-methoxyestradiol：New developments［J］.Drug Res Updates，2003，6（6）：355-361.