细胞移植在自体脂肪填充中的应用进展

杨懿爱 综述 郑丹宁 李青峰 审校

自体脂肪是良好的软组织充填材料。目前，抽吸技术和移植技术日益成熟。脂肪注射充填技术的主要问题是移植后的脂肪吸收，以及局部脂肪坏死。随着再生医学研究的深入，使用各类细胞辅助脂肪移植进行临床治疗越来越普遍，有大量文献进行了相关报道。然而，目前使用干细胞以及其他生物方法辅助脂肪移植的方法尚未统一，本文就细胞辅助脂肪移植的现状进行综述。

1 脂肪移植技术存在的问题

目前，脂肪移植后吸收率较高的问题仍未得到解决，脂肪移植后吸收率为20%～90%[1]。有众多研究对脂肪移植技术进行了改进，如小体积多层次低负压的移植方法，尽可能确保移植颗粒脂肪的活性，解决了小剂量的脂肪充填难题，但是较大剂量的脂肪移植还是存在液化、坏死、吸收等并发症。

脂肪移植技术因吸收率不稳定而导致的应用限制[2-3]。2006年，Wolf等[4]随访10位使用自体脂肪充填臀部的患者，移植量约350 mL，术后1年内平均吸收率达到24%～36%，认为早期的吸收率无法避免，脂肪移植体积在手术后1年渐趋稳定。

除吸收率高之外，有报道认为自体脂肪移植丰乳术后脂肪易坏死，易形成囊肿、硬结和钙化点[5-6]，Illouz等[3]随访820位自体脂肪移植丰乳患者，随访时间约11.3年，认为脂肪移植丰胸技术主要的问题是局部囊肿、硬结的形成。Spear等[7]随访37位患者，随访时间平均49周，1例单侧乳房出现蜂窝组织炎，3例出现乳房体积减少及浅表肿块，出现肿块的患者中有2例组织活检发现坏死、囊肿。Spear等[8]认为只有技术熟练经验丰富的外科医生才可以降低自体脂肪移植的并发症，患者在进行自体脂肪丰胸前都应被告知术后应接受长期影像学随访，应了解脂肪移植有钙化、囊肿形成、新生乳房肿瘤难以辨识等并发症可能。为克服常规注射脂肪移植的问题，Yoshimura等[9]提出CAL技术，已应用于临床，自体脂肪干细胞与脂肪细胞联合辅助自体脂肪丰胸，可有效减少局部并发症的发生。

2 细胞移植应用于脂肪移植的现状

2.1 脂肪来源细胞

，脂肪来源干细胞辅助移植，是目前应用最多的辅助移植方法。Zuk等在2001年，首次从自体脂肪组织中分离出具有多向分化潜能的细胞，即脂肪干细胞（Adipose-derived stem/stromal cells，ADSCs），抽吸的脂肪经分离培养即可获得ADSCs。脂肪的基质血管成分 （Stromal vascular fraction，SVF），同样取自脂肪抽吸物，经过胶原酶消化、过滤、离心去除成熟脂肪细胞，分离出富含脂肪干细胞的离心层，即为SVF，包含有多种细胞，其中就包括ADSCs。SVF和ADSCs都是脂肪来源的，但ADSCs的获取过程复杂，需将脂肪细胞分离、培养，培养的过程中增加了污染风险，经过培养的ADSCs干细胞虽然纯度较高，但经过多次传代，可能分化成其他细胞；而SVF无需培养，获取过程简便。

2006年，Matsumoto等[10]将ADSCs与颗粒脂肪混合移植于小鼠皮下，使用脂肪干细胞辅助移植的脂肪体积大于未使用脂肪移植组35%，使用脂肪干细胞辅助移植的脂肪在Dil染色下血管内皮细胞较未使用脂肪移植组高；2009年，Yoshimura将此技术命名为自体细胞辅助脂肪移植技术（Cell assisted lipotransfer，CAL）。该技术将ADSCs提取与颗粒脂肪移植技术相结合，首先使用负压吸脂术抽吸患者多余脂肪，将所取的颗粒脂肪分成两部分，一部分用于提取ADSCs，一部分用于脂肪移植，提取好后混合两部分共同移植至患者自身体内，移植的脂肪即为脂肪干细胞富集的脂肪颗粒，取得良好疗效。普通脂肪移植的过程中，移植物中含有一定成分的脂肪干细胞，经过上述处理的目的是增加单位颗粒脂肪移植物中脂肪干细胞的含量[9]，随访使用CAL方法丰胸患者1年，充填量约为264 mL，术后2个月无明显脂肪吸收，术后1年脂肪存活率左侧（155±50） mL，右侧存活率（143±80） mL。自体脂肪移植丰乳有可能取代假体丰乳[12]。

Kamakura等[13]使用自动提取干细胞装置Celution 800 system，将经过洗涤和分离的干细胞辅助脂肪移植，每克脂肪组织可以提取3.42×105个干细胞，机器分离前测量脂肪活性约为85.3%，9个月后随访了20位日本女性患者，患者术后胸围较术前增加3.3 cm，术后有2位患者出现脂肪囊肿。

Min等[14]为了解决脂肪移植术后远期的脂肪存活问题，在动物实验中使用ADSCs辅助脂肪移植，发现在移植6个月及9个月后，添加ADSCs的实验组脂肪体积较对照组大两倍，并且添加ADSCs的实验组毛细血管密度较对照组高，移植后的脂肪经过细胞示踪及基因表达研究发现，ADSCs可能有增加毛细血管密度的作用，ADSCs可分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞，促进血管生成，促进脂肪细胞再生，并分泌VEGFA和IGF-1等生长因子，可防止脂肪细胞凋亡。Mojallal等[15]将人体脂肪细胞混合ADSCs以及胶原支架，分别移植于裸鼠皮下，2个月后取材并行组织学检测，该实验分7组：①纯化颗粒脂肪组，脂肪组织经过3000 r/min离心弃上层液体后取中间层新鲜移植至裸鼠皮下，术后2个月体积为最初移植的81.8%，脂肪血管化良好、脂肪成活；②相同条件离心后再经胶原酶消化后的脂肪细胞组，移植2个月后，体积为最初的22.5%，完全吸收占50%，50%的脂肪组织肉眼观察有纤维组织，组织学检测有脂滴以及空泡；③经培养后的ADSCs组不添加胶原支架，脂肪体积为最初移植的5.3%，完全吸收占60%，40%肉眼可见纤维组织增生，组织学检测几乎无残余的脂肪细胞和新生血管；④胶原支架不含脂肪细胞组，体积为最初移植的72.2%，完全吸收0%，肉眼见白色无血管化的组织，胶原支架上细胞少；⑤培养后的ADSCs加胶原支架以及生物活性因子组，完全吸收0%，在移植2个月后体积为最初移植的87.3%，肉眼观察脂肪组织在胶原支架上生长，成熟脂肪细胞可见，有丰富的新生血管；⑥ADSCs加胶原支架不加生物活性因子组，形态上与不加生长因子组无显著差异，体积为最初移植的79.1%；⑦新鲜获取的ADSCs添加胶原支架组，移植2个月后，体积为最初移植的70.4%。实验证明，添加胶原支架以及培养后的ADSCs有防止脂肪萎缩的作用，移植后2个月体积仍为最初移植的87.3%，生物活性因子也有促进脂肪生长的作用。Levi等[16]发现，hADSCs在鼠颅骨早期创伤模型中起到促进骨愈合的作用，在鼠创伤部位将富血小板血浆与人的ADSCs混合，模拟早期损伤后体内环境，与hADSCs接触的颅骨即刻出现骨愈合，对照组陈旧性颅骨损伤骨质增生有限，促进骨愈合的机制可能与ADSCs激活内源性BMP系统有关。

Feng等[17]使用VEGF转染的脂肪干细胞移植至裸鼠的皮下促进血管新生和存活，移植6个月后，毛细血管密度增加、脂肪细胞坏死和纤维化减少，使用VEGF转染的脂肪移植术后体积较对照组增加，实验组新生毛细血管上发现用于标记脂肪干细胞的Dil标记物，认为新生毛细血管是由ADSCs分化的。由于脂肪组织的血管新生发生在移植后的48 h，因此，脂肪组织在这段时间里遭遇缺氧，将会发生细胞核碎裂、细胞膜破裂，导致囊肿（Fatty cysts）形成，游离的脂滴部分被吸收，造成术后存活率不稳定，余下的脂滴形成脂肪液化坏死。因此，使用VEGF转染的ADSCs可以起到加快脂肪移植后缺氧早期的毛细血管新生，改善脂肪早期缺血、缺氧状态。ADSCs与BMSCs同样具有恢复血流的能力[18]。研究表明，ADSCs与BMSCs移植后具有促进创伤修复和促进血管新生的作用[19]。ADSCs移植后，通过内分泌、旁分泌、多向分化的作用，以及调节局部炎症反应的作用，促进移植脂肪的成活。

ADSCs辅助脂肪移植进行丰乳手术，目前已经应用于临床，Tiryaki等[20]在一项临床应用研究中，对29例进行了ADSCs辅助脂肪移植丰乳术，移植量10～390 mL，术后随访10个月，所有的患者皆不需二次脂肪注射即达到良好的美容效果。他们认为，富集的ADSCs在脂肪移植早期起到了促进血管新生的作用，减少了脂肪萎缩，防止脂肪细胞凋亡，调节局部炎症反应，达到了良好的临床效果。Lo Cicero等[21]使用ADSCs辅助脂肪移植，治疗声带麻痹、声门闭合不全患者12例，认为ADSCs在脂肪移植中具有促进脂肪长期存活的作用，促进了声带细胞外基质分泌，效果优于单纯的脂肪移植。

2.2 骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种纤维样成体干细胞，约占骨髓中有核细胞的0.001%～0.01%[22]。

Mauney等[23]使用Ⅰ型变性胶原基质（Denatured Collagen typeⅠ）辅助BMSCs体外扩增，能够有效促进BMSCs向脂肪细胞分化。Webb等[24]认为，BMSCs和ADSCs同样属于间充质干细胞，体内实验证实ADSCs相比BMSCs增殖速度更快，更易获取，较适于临床应用。

2.3 胚胎干细胞

1998年，Thomoson等[25]将人胚胎干细胞移植至裸鼠体内生成畸胎瘤，包含内、中、外3个胚层的组织，如神经、骨、软骨、消化道上皮等，证明胚胎干细胞具有多向分化潜能。Hillel等[26]认为，胚胎前体细胞具有自我更新能力，可以尝试在组织工程化脂肪构建中应用，但胚胎干细胞存在伦理学争议，且存在致瘤性风险，临床尚无法应用。Rebelatto等[27]比较了各种间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs），发现 BMSCs与ADSCs分化成软骨和骨的能力相似，但ADSCs分化为脂肪的能力较高。

2.4 富血小板血浆

富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）是自体全血通过离心得到的血小板浓缩物，1993年Hood等[28]首先提出，并发现PRP含有丰富的血小板，其数目比全血中数目高3倍以上，并富含血小板因子（Platelet factor 4，PF4）、血小板血管生成因子（Platelet-derived angiogenesis factor，PDAF）、血小板内皮生长因子 （Platelet-derived endothelial growth factor，PDEGF）、胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor，IGF）、内皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨钙素（Osteocalcin）、骨连接素（Osteonectin）、纤维蛋白原（Fibrinogen）、纤维连接蛋白 （Vitronectin）、凝血酶敏感蛋白（Thrombospondin）等生长因子。PRP无免疫原性，不会引起交叉感染，制备使用方便，价格低廉，有良好的应用前景，在创伤修复中起着重要的调节作用[29-30]。

PRP已辅助用于临床脂肪移植。2009年，Cervell等[31]使用患者自体的PRP辅助脂肪移植，治疗15位面部软组织填充患者，术后疗效满意。他们认为，PRP含有多种生长因子，当血小板活化后，释放生长因子，对脂肪增殖有促进作用。他们还比较使用SVF和PRP辅助脂肪移植对下肢创伤后溃疡的疗效，结果显示使用SVF和脂肪移植联合PRP辅助治疗可以加快表皮再生速度，对创伤修复有一定的疗效。

Nakamura等[30]研究PRP对脂肪成活和吸收的影响，他们提取健康大鼠PRP后，和大鼠脂肪联合移植至大鼠皮下，实验组加入PRP后，移植脂肪在术后30～120 d脂肪呈粉红色，柔软，触之有弹性，对照组单纯脂肪移植在30 d后出现显著吸收。组织学显示，移植后10 d脂肪细胞形态和数量相似，PRP组毛细血管密度高；移植20 d后，对照组正常脂肪细胞量减少，实验组脂肪细胞量维持不变。

3 细胞辅助移植的局限性和前景展望

3.1 细胞移植途径和安全性

ADSCs与BMSCs一样，在体外具有向脂肪、骨、软骨、神经、心肌、平滑肌及骨骼肌等多个谱系分化的能力。ADSCs可分化为血管内皮细胞，且在缺氧环境下可分泌促进血管形成的细胞因子，从而促进脂肪移植后的血管化进程；ADSCs可以产生和分泌血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF-2）、转化生长因子（TGFβ）、肝细胞生长因子（HGF）等多种细胞因子，在造血支持作用、趋化作用、免疫抑制和免疫调节中发挥功能[14-15，17，21]。

使用细胞辅助移植可以提高移植术后脂肪的存活率，但体外培养需要扩增，最少需要2～3周的时间，如果患者使用自体脂肪细胞辅助移植，就需要二期手术。不仅如此，体外培养操作繁琐，需要专业的研究人员和相应的硬件设施，等待二次手术的时间里存在污染风险，安全性低。

因此，使用脂肪组织中新鲜分离的SVF辅助脂肪移植，既可避免交叉感染，具有较高的安全性，又能一期完成手术，易于临床推广，PRP也有提取方便和安全性较高的优点。

3.2 细胞移植后的作用机制

细胞辅助移植后促进血管化的机制尚不明确，在脂肪细胞受区血管化过程中，各种因子之间相互协调，共同发挥作用。辅助移植的细胞可以持续分泌多种因子，如肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、 成纤维细胞生长因子（Fibmblast growth factor，FGF）、VEGF、IGF、SDF-I、Angl等，可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移、形成管状结构，并募集周围组织和血循环中的内皮祖细胞，促进其分化为内皮细胞[32]。此外，植入的细胞还可以通过分化为血管内皮细胞，参与新生血管壁的形成；或者作为促血管化生长因子基因的载体，从而显著提高移植脂肪的成活率[15，32]。

脂肪移植后，体内局部微环境发生改变，新生血管未生成，缺氧会影响植入脂肪的存活率，并导致微环境中的细胞因子、细胞外基质逐渐减少，影响最终的治疗效果[12]。因此，了解脂肪移植后的转归，对抗早期缺氧，调节脂肪细胞与辅助细胞的作用，可能会成为未来的研究方向。

随着对于细胞辅助移植后脂肪的转归、作用机制、调控机理等的深入研究，细胞辅助脂肪移植有望解决长期存在的脂肪移植的液化、坏死等并发症，使得脂肪移植技术能更好地应用于临床。

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