NADPH-d染色法术中快速诊断先天性巨结肠

朱利斌，张普，黄婷，王永彪

（温州医学院附属育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.儿外科；2.病理科）

先天性巨结肠（Hirschprung’s disease，HD）手术治疗效果如何，依赖术中是否准确切除病变肠管，但仅凭术者经验，过多切除正常的肠管，则正常肠管总长度减少，患儿易患营养不良、慢性腹泻等疾病，而且增加手术时间及手术风险；反之切除肠管过少，病变段肠管未完全切除，患儿仍有持续便秘，需再次手术，增加患儿的痛苦及经济上的压力。因此，在手术中急需一个行之有效、快速、规范、易操控的、客观的诊断方法。以往的术中快速诊断方法有：冰冻切片HE染色、乙酰胆碱脂酶（AchE）染色、乳酸脱氢酶（LDH）染色法等，对肠神经节细胞的有效识别率不高，操作流程繁琐，并且诊断依赖于病理科医师的主观经验，均不甚理想。本研究改进了一种基于NADPH-d的快速组织学染色方法，供手术当中快速诊断HD，确定肠管切除范围，介绍如下。

1 材料和方法

1.1 标本及分组 本研究所用标本均取自手术中切除肠管，并经我院伦理委员会批准。自2008至2011年37例HD患儿术中切除的结肠，其中男27例，女10例，年龄5～19个月，平均11.6个月。分扩张段、移形段、狭窄段，制片后分批超低温冰箱保存，以非HD结肠造瘘切除标本作为阳性对照。分NADPH-d快速染色法组、冰冻切片HE染色法组。

1.2 制片 标本常规冰冻连续切片，片厚4μm，多聚赖氨酸载玻片贴片，取奇数切片做NADPH-d的快速组织学染色，偶数切片做冰冻切片HE染色。

1.3 NADPH-d的快速组织学染色方法 反应液组成：1 mL 0.1 mol/L PB（pH 8.0）液中加入0.5 mg NADPH-d（Sigma）、0.6 mg NBT（Sigma）、10μL二甲基亚砜（苏州正兴化工研究院）、3μL Triton X-100（北京拜尔迪生物公司）。滴加反应液后载玻片置于37 ℃水浴箱中10 min，观察反应液由黄色变微紫色后取出，光镜下观察神经节细胞显示清晰后PBS冲洗终止反应，水性封片剂封片。阴性对照：反应液中不加入NADPH-d。阳性对照：已知阳性组织（结肠造瘘切除标本）同时进行染色。

1.4 冰冻切片HE染色方法 冰冻切片切好后，室温下干燥。4%多聚甲醛固定5 min，蒸馏水洗2 min，苏木素染（37 ℃）1 min，自来水冲洗5 min，95%乙醇5 s，伊红染液20～30 s，70%乙醇洗2次，95%酒精30 s，100%酒精30 s，95%酒精2道每次30 s，100%酒精2道每次30 s，100%二甲苯2道，第一道10 min，第二道5 min，中性树胶封片后镜下观察。

1.5 双重染色 NADPH-d的快速组织学染色完成后，自来水冲洗5 min，采集图像后再行冰冻切片HE染色，完成后相同条件下再次采集图像，存档后观察比较。

1.6 观察指标 光镜下观察：①扩张段肌间神经丛着色情况，神经节细胞是否可轻易识别，与背景有无强烈反差。②移行段结果：神经丛、神经节细胞在数量、大小、分布范围与扩张段相比如何。③狭窄段有无阳性神经节细胞分布，背景着色情况。

1.7 统计学处理方法 全部数据采用SPSS for windows 13.0软件进行统计学处理，两种不同处理组间比较采用配对x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扩张段 扩张段经冰冻切片HE染色后，30 min内出结果，镜下肌间神经丛、神经节细胞隐约可见，背景组织细胞极多，故反差不大，若无丰富的经验积累，即使病理科医师也较难在短时间内分辨出神经节细胞，准确判断术中结肠切缘是否已达正常肠段（见图1）。与此相反的是NADPH-d的快速组织学染色，滴加反应液后10 min内出结果，背景清晰；低倍镜下可见环肌和纵肌之间丰富的神经丛呈串珠状分布（见图2），高倍镜下可见大量神经节细胞，其胞浆着紫色，胞核空白无着色（见图3）为判断神经丛所处位置及与冰冻切片HE染色结果进行比对，故对原先NADPH-d处理的切片采集图像后再进行快速HE染色，结果证实原先串珠状分布的紫色组织，即为肌间神经丛（见图4）；高倍镜下可清楚分辨核大、深染、胞质略呈嗜碱性的神经节细胞（见图5）。

图1 冰冻切片HE染色显示肌间神经丛（×400）

图2 扩张段NADPH-d的快速组织学染色（×100）

图3 扩张段肌间神经丛及神经节细胞（×400）

图4 双重染色后扩张段肌间神经丛及神经节细胞（×100）

图5 双重染色后扩张段肌间神经丛及神经节细胞（×400）

图6 移行段NADPH-d的快速组织学染色，见神经丛分布稀疏（×100）

图7 移行段双重染色，见神经丛分布稀疏（×100）

2.2 移行段 低倍镜下可见少数着色神经丛，神经丛之间距离较大，分布较扩张段明显稀疏（见图6），高倍镜下神经节细胞可清楚分辨，但每个神经丛内节细胞数量及大小远不如扩张段。移行段双重染色后可证实沿肌间分布的神经丛，与单用NADPH-d快速染色结果相符（见图7）。

2.3 狭窄段 狭窄段NADPH-d的快速组织学染色，镜下见背景清晰，无任何着色，未见神经丛及阳性神经节细胞（见图8）。快速HE染色，可见肌间杂乱分布的肥大神经纤维束，无任何阳性神经节细胞（见图9），背景组织细胞繁多，不易判断结果。

图8 狭窄段NADPH-d的快速组织学染色，未见阳性神经节细胞（×100）

图9 狭窄段快速HE染色，无阳性神经节细胞（×100）

2.4 两种方法诊断结果比较 快速NADPH-d法和HE法配对比较37例（见表1），结果NADPH-d法2例阴性，HE法有3例阴性，经统计学分析，两种方法阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 快速NADPH-d法和HE法结果比较（n=37）

3 讨论

HD是一种儿童常见的消化道发育畸形，可以引起婴儿肠梗阻和慢性便秘，在我国的发病率约为1:5000，为小儿外科最常见的先天性畸形之一。临床上常见的诊断方法如钡剂灌肠造影、肛门直肠测压、直肠黏膜活检术，很难准确判断病变的范围，准确性和敏感性很难达到临床要求。即使手术前行直肠黏膜活检术，依靠HE染色镜检，也只能从镜下观察神经节细胞的有无去判定巨结肠诊断是否成立，而无法确定病变肠管的范围。一般而言，在手术中根据术者经验及肠管的大体观察去判断病变段肠段范围，如术中行快速冰冻切片HE染色，遇到不典型病例或病理科医师经验不足，明显会影响肠管切除范围的判定，导致手术效果不佳，部分患儿还有反复的便秘或大便失禁，需再次手术切除剩余部分病变肠管，严重影响患儿的生活质量[1-2]。

目前研究较多的术中快速诊断方法有：冰冻切片HE染色法、AchE染色、LDH染色法，但都不甚理想。如前所述，HE染色法可以观察肠壁有无神经节细胞的存在，神经纤维有无异常增生，如果全部切片都未见神经节细胞，则可诊断为HD。但小儿的神经节细胞发育是一个逐渐成熟的过程，尤其在新生儿时期，发育更是不成熟，故HE染色对于识别发育未成熟、结构不典型的神经节细胞有一定难度，因此经验在诊断上特别重要，直接影响诊断的准确率。与此相反，NADPH-d的快速染色法对于神经节细胞具有高识别性，Montedonico等[3]认为特别适合诊断新生儿期HD。另外HE染色流程中需固定、脱水等较多步骤，耗时长。在HD病变段肠管中，AchE活性异常升高，通过AchE染色显色反应可看到胆碱能神经纤维大量增生，过去该流程要花费数小时，影响术中快速诊断的应用。Kobayashi等[4]改进了新方法，使染色时间缩短到6 min，使术中快速诊断成为可能。但AchE既存在于胆碱能神经元也存在于非胆碱能神经元，假阳性率高，且在新生儿中易出现假阴性，所以目前较少单纯用AchE染色来诊断HD。有报道称HE法和AchE染色两者结合可以更好诊断HD，但增加了大量操作步骤及时间[5]，不利于术中快速诊断。至于LDH染色法，因能在神经节细胞中形成蓝紫色颗粒状沉淀物，有时候也能判断出无神经节细胞肠段的范围[6]，但这种酶对神经节细胞及神经纤维缺乏特异性，而且一般要联合应用AchE染色，故不建议用于巨结肠的诊断[5]。

本研究中扩张段肠管经NADPH-d的快速染色，可见环肌和纵肌之间丰富的神经丛，呈串珠状分布，高倍镜下可见大量阳性神经节细胞，背景无着色。与HE法配对比较HD 37例，结果NADPH-d法2例阴性，其中1例经证实为全结肠型巨结肠。HE法有3例阴性，其中有2例再经NADPH-d法检测证实为阳性，考虑肠神经元发育不良，神经节细胞形态不典型，故无法识别；另外1例全结肠型巨结肠，因取材因素，无阳性结果。

综上所述，本研究建立了一种以NADPH-d酶组织化学方法为基础的肠神经节细胞快速染色方法，用于术中快速诊断先天性巨结肠，确定肠管切除范围。经过双重染色证实，NADPH-d法显示的阳性神经丛与神经节细胞与HE法完全相符，且染色背景清晰，无干扰，说明该方法切实可行。在前期实验中，课题组摸索了各种反应条件、流程，发现该反应液配置简单，易掌握，切片不需事先固定，也不同于其他染色方法，无需水化、脱水、染色等流程，避免接触二甲苯等致癌物质[7-8]，而仅需在37 ℃条件下滴加反应液，10 min左右即出结果。该方法新颖，诊断快速，较冰冻切片HE染色法具有一定优越性。但目前仅是一个初步研究结果，样本均为典型HD病例，对于HD类缘病诊断结果如何，尚需进一步研究。

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[4] Kobayashi H, Miyahara K, Kusafuka J, et al. A new rapid acetylcholinesterase staining kit for diagnosing Hirschsprung’s disease[J]. Pediatr Surg Int, 2007,23(5):505-508.

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