体外再生胰岛移植治疗糖尿病的研究近况

迟欣 周光纪

体外再生胰岛移植治疗糖尿病的研究近况

迟欣 周光纪

糖尿病是因胰岛素抵抗和(或)胰岛功能损害所致的以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。传统治疗方法以药物治疗为主。药物治疗能控制症状，但不能彻底治愈糖尿病。胰岛移植是目前治疗糖尿病的有效方法，但胰岛供体的严重缺乏使其推广应用受到了很大限制。由于干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，理论上可为胰岛移植提供丰富的胰岛细胞来源。近年来，对于胚胎干细胞、胰腺干细胞、间充质干细胞以及诱导性多功能干细胞等诱导分化为胰岛样干细胞的研究为糖尿病治愈带来了新希望。

一、胰岛移植现状

过去的临床实践发现，胰腺移植是治疗糖尿病的有效方法[1]。然而由于胰腺移植需要同时处理胰腺的内分泌和外分泌问题，手术方式复杂，并发症多。更重要的是，胰腺移植组织配型困难，移植排斥严重。与传统的胰腺移植或胰腺-肾脏联合移植相比，胰岛移植时没有招致排斥反应的重要结构——血管，也没有复杂的外分泌问题需要处理，而是可以采用注射等简单方法移植于肝脏、皮下、肾包膜等合适部位，术式简单，手术创伤小，移植排斥弱，并发症少，因而更易于在临床开展[2]。在早期的胰岛移植临床研究中发现，1型糖尿病患者胰岛移植后短期不依靠外源性胰岛素者达到了百分之十[3]。后来，加拿大埃德蒙顿市阿拉伯塔大学的一个研究小组通过认真的病例选择和胰岛分离、纯化过程的优化，首次采用了不使用具有胰岛毒性的类固醇激素的抗移植排斥的方法，使胰岛移植患者术后不依赖胰岛素的时间长达一年之久。这在胰岛移植领域具有“里程碑”式意义，被誉为“埃德蒙顿方案”(Edmenton protocol)[4]。2008年美国联合胰岛移植注册网站上发布的数据称，1999至2007年间279位接受胰岛移植的患者中有23%不依赖胰岛素生存3年以上，5年的随访报告称65位注册的患者中有10%不依赖胰岛素生存5年以上[5]。像其他器官移植一样，胰岛移植也存在严重的器官供体短缺，而且更为严重。即使是赢得一致赞誉的埃德蒙顿方案，也需要2～3个成年胰腺供体才能满足一个成年患者的移植需要，这不仅使器官供体短缺问题更加突出，还使本来已不易解决的移植排斥问题更加复杂。因此，找到新的胰腺β细胞的来源成为人们研究的热点。

二、干细胞再生胰岛移植治疗糖尿病

由于干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，理论上可以将其定向诱导分化，形成“人工胰岛”，为胰岛移植提供丰富的胰岛细胞来源。其中以胚胎干细胞、胰腺干细胞和间充质干细胞的研究最引人关注。

1．胚胎干细胞定向分化诱导产生的“人工胰岛”移植治疗糖尿病：胚胎干细胞是来源于胚胎囊胚期“内细胞团”的一种未分化全能型细胞，具有强大的自我更新能力并能分化为机体所有类型的组织细胞。它强大的自我更新能力和全能分化特性使其成为胰岛β细胞替代治疗(β-cell replace therapy)的种子细胞来源。Sofia等[6]将人Ins基因通过载体转入小鼠胚胎干细胞后诱导分化成能分泌胰岛素的β-样细胞。体外检测这些细胞分泌胰岛素的量可随糖浓度的增加而增加。将这些来源于胚胎干细胞的β样细胞植入1型糖尿病小鼠体内后，其血糖正常可达1年以上。但Lumelsky等[7]用5步法将小鼠胚胎干细胞诱导分化成的类似胰岛结构细胞的胰岛素分泌量仅相当于正常细胞分泌量的1/50，这些细胞移植到糖尿病小鼠并不能纠正高血糖。周光纪等[8]改良了Lumelsky的诱导方法，经过5阶段约28～32 d的连续培养诱导，将小鼠的ESC细胞诱导成具有胰岛素分泌功能的胰岛样β细胞，在培养液中加入磷酸肌醇激酶抑制剂，将胰岛样细胞分泌的胰岛素含量提高到正常细胞分泌量的1/10并能轻度改善高血糖状态。我们实验室经过优化，使ESC分化为胰岛素分泌细胞的时间从文献报道的18～32 d缩短为18 d左右。将这些胰岛素分泌细胞移植肝内6 d后血糖明显下降，但未恢复到正常水平；而移植腹股沟区皮下6 d血糖降至正常[9]。刘星霞等[10]将胚胎干细胞诱导的胰岛样细胞团两次皮下移植于DM小鼠，第5天血糖水平显著降低，但仍未能降至正常水平。Lester等[11]利用荧光标记的方法证实，恒河猴胚胎干细胞可以分化成能够分泌胰岛素的细胞，为临床模型奠定了基础。Duvillie等[12]证实人胚胎干细胞体外在葡萄糖刺激下可以分化为胰腺β样细胞，可以在培养基中分泌胰岛素。Kroon等[13]利用人胚胎干细胞诱导得到胰腺内胚层，移植入小鼠体内后能够根据血糖的波动相应地产生适量的胰岛素，移植入小鼠体内产生胰岛素的细胞表现出许多像β细胞转录因子等功能性β细胞的特征性标记物。

虽然诱导胚胎干细胞向胰岛定向分化的潜能得到证实，但由于对胚胎干细胞向胰岛β细胞分化的关键过程缺乏了解，所以至今没有一种真正权威的诱导方法。转化效率低、胰岛素分泌功能差是目前存在的主要问题。

D′Amour等[14]通过调整培养基中生长因子和小分子抑制剂的成分，从hES细胞系(CyT203)获得有胰岛素分泌功能的细胞，在诱导分化5个阶段中PDX-1、NGN3、INS以及GCG的表达水平和人体胰腺发育过程中对应阶段相同。并应用蛋白质印迹法和免疫荧光技术证实，由hES分化来的细胞胰岛素分泌水平与人体胰岛的水平相当。Assady等[15]将用改良的四步法诱导hES得到的胰腺细胞移植到裸鼠皮下，移植两个月后血清中C肽含量快速升高，3个月时血清C肽蛋白含量与小鼠移植3000～5000个人胰岛的分泌量相当。经免疫组化证实，由hES分化来的细胞具有完整的β细胞特性。将这些细胞移植到用STZ破坏了胰岛的小鼠，并没有因为内源性胰岛的破坏而影响对血糖的调节，说明hES分化来的内分泌细胞在调节血糖的过程中起到了关键作用。

2．胰腺干细胞诱导分化形成“再生胰岛”治疗糖尿病：胰腺干细胞主要存在于胰岛中，也有少量存在于胰腺导管上皮细胞中。从胰腺干细胞产生“再生胰岛”一般有体外扩增诱导和体内诱导两种方法[16]。Vaca等[17]从人胰腺导管上皮细胞中分离到胰腺干细胞，经体外培养后得到有胰岛样结构的细胞团，但其扩增的周期长,所得细胞数量少。我们课题组王燕虹用正交设计优化了培养基成分和人胚胎胰腺干细胞的分离纯化方法，从妊娠4～6个月流产的胎儿胰腺组织中分离胰岛，然后将胰岛贴壁培养，扩增胰岛中的胰腺干细胞。结果发现，扩增15代后,细胞总数可达原来的1010倍；具有胰腺干细胞标志的ABCG2阳性细胞和nestin阳性细胞可达原来的1012倍，且ABCG2阳性细胞的扩增能力要优于nestin阳性细胞。这些经连续扩增的细胞经过体外定向诱导可形成具有胰岛素分泌功能的细胞，自发聚集成具有胰岛样结构的胰岛样细胞团(islet-like cell clusters,ICCs),并对葡萄糖刺激敏感[18]。Ramiya等[19]从未发病的成年非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的胰导管上皮中分离出胰腺干细胞，经体外扩增并诱导分化为胰岛样细胞团，移植后两周内血糖有所下降，但血糖浓度仍高于正常水平。Huang[20]、Wu等[21]的研究也将人胎儿胰腺组织来源的胰腺干细胞诱导分化为胰腺内分泌细胞，移植入糖尿病小鼠体内可纠正其高血糖。赵婷等[22]发现，移植胰腺干细胞后的大鼠在移植后第6周血糖开始降低并且能够长时间使血糖维持在较低的水平，但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌。张悦、楚元奎等[23-24]分别从胎鼠及胎猪中分离得到胰腺干细胞，经体外扩增后移植入相应糖尿病模型，发现胰岛样干细胞在体内微环境的调节下增殖为胰岛样结构，并且受体的血糖水平得到了较好控制。

3．间充质干细胞再生胰岛移植治疗糖尿病：文献报道，骨髓、脐带血来源的间充质干细胞，通过对pdx-1基因的诱导，也会具有胰岛β样细胞的特征，并且具有取材方便，体外诱导、分离、培养和纯化简单的特点[25]。余卫等[26]从胎鼠肝脏中分离出间充质干细胞诱导分化为胰岛样β细胞，移植到1型糖尿病小鼠的肾被膜下，6周后小鼠的血糖得到良好的控制。脐带、骨髓来源的干细胞也成功被诱导分化为胰岛β样细胞，在大鼠的糖尿病模型中得到应用并取得良好效果。庞荣清等[27]将骨髓来源的β样细胞移植于弥猴，证实可以使血糖、胰岛素和c肽的分泌回复正常。

4．诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)在糖尿病治疗中的前景：随着新技术的应用，人的成体细胞能够被重新诱导成象胚胎干细胞一样的多能干细胞——诱导性多能干细胞[28]。诱导性多能干细胞的成功获得使得胰岛β细胞的来源有了新的前景。2009年，Maehr等[29]用1型糖尿病患者的成纤维细胞诱导出iPS细胞分化出了具有胰岛素分泌功能的细胞，为糖尿病的治疗开辟了新的途径。iPS的出现使可以自体移植、完全不出现移植排斥的“自体胚胎干细胞”成为现实，是近年来最令人鼓舞的进展。

三、问题与展望

干细胞体外定向诱导成胰岛素分泌细胞移植，为糖尿病的治疗带来了新的希望，但仍有诸多问题需要解决。(1)转化效率问题：目前从干细胞分化为胰岛素分泌细胞的转化效率较低，大量干细胞诱导后仅能得到数量有限的胰岛素分泌细胞，且其功能较差，远远不能满足临床实际运用的要求。(2)分化细胞的“年龄结构”问题：干细胞在体外扩增后同步诱导分化，所有细胞均同步分化为成熟细胞。这些细胞移植后，同步地生长、衰老，最后也同步消亡，使疗效完全丧失。这显然不符合治疗的要求。如何能使移植细胞具有“年龄结构”，做到“可持续发展”，长期保持疗效，是今后要解决的重要问题。(3)移植排斥问题：异体来源的干细胞形成的胰岛素分泌细胞是否具有免疫原性，过去未受到足够重视。我们最近刚完成的实验发现(资料待发表)，在胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中，引起移植排斥的主要组织相容性抗原(MHC)表达进行性增加，激活淋巴细胞的能力也相应地增强，移植后出现强烈的移植排斥反应。这说明和传统的组织器官移植一样，胚胎干细胞衍生的组织、器官移植也一样面临排斥问题。间充质干细胞和诱导性多能干细胞有可能实现“自体移植”，避免移植排斥，但其他问题依然存在。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.027

国家自然科学基金(30772769)，广东省科技计划项目(63044)

524023 广东湛江，广东医学院生理学教研室

周光纪，Email:gdmczhou@126.com

2011-10-13)

(本文编辑：吕芳萍)