胰腺癌基因治疗进展

汤晓东 刘双海

·综述与讲座·

胰腺癌基因治疗进展

汤晓东 刘双海

胰腺癌多发生于中老年人，发达国家发病率高于发展中国家。随着我国生活水平的提高和饮食结构的改变，近年来胰腺癌的发病率呈现上升的趋势，并且有年轻化的倾向。目前对于胰腺癌的治疗方法主要包括手术切除、放化疗、基因治疗、内分泌治疗、中医治疗等，但仍没有彻底治愈的方案，各国学者仍在致力于研究更有效的治疗方法。近年来，分子靶向治疗成为肿瘤治疗领域的新热点，本文就胰腺癌的基因治疗方面取得的最新研究成果做一综述。

一、反义基因治疗

反义基因治疗技术的原理是反义寡核苷酸以互补的形式与特定的DNA或RNA序列结合，从而阻止DNA的转录或RNA的翻译，使肿瘤基因无法表达。在胰腺癌中，最常见K-ras基因突变，因此，K-ras基因常作为胰腺癌基因治疗的靶点。此外，通过反义核酸技术使突变基因ATK2、cerbB2激活抑癌基因表达，从而达到治疗目的。Morioka等[1]应用靶向K-ras的反义寡核苷酸转染胰腺癌细胞HaP-T1可抑制其增殖，且能使基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白-9(MMP-9) 的活化下调；在动物体内种植瘤实验中，应用反义寡核苷酸治疗的动物生存期显著长于对照组，且发生淋巴结转移的时间更晚。我国学者韩旭等[2]应用电转染方法分别用整合素αV、β3及αVβ3反义基因治疗胰腺癌大鼠，结果发现，对照组、αV组、β3组及αVβ3组肿瘤质量分别为 (1.17±0.79)、(0.95±0.26)、(1.013±0.42)和(0.79±0.56)g；微血管密度分别为18.33±1.39、13.80±1.06、15.96±1.24和12.16±1.23；肿瘤细胞凋亡指数分别为12.30±1.393、22.17±1.23、20.37±1.07和24.10±0.99，各组间差异均具有统计学意义。作者认为，应用整合素αV、β3和αVβ3反义基因治疗可通过抑制癌组织血管生长，促进癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长。

二、自杀基因治疗

自杀基因治疗也称作前体药物敏感基因疗法(prodrugsensitive genes therapy)，是利用转基因的方法将哺乳动物本身不含有的药物酶基因转入肿瘤细胞内。该基因表达的产物可以将无毒的药物前体转化为有毒性的药物，从而干扰肿瘤细胞DNA的合成，杀死肿瘤细胞[3]。Eisold等、Fogar等[4-5]研究报道，胞嘧啶脱氨酶(cystodine deaminase，CD)能够催化5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)，因5-FU具有强烈的细胞毒作用，能够抑制DNA和RNA的合成，从而导致细胞死亡，因此CD基因是一种自杀基因。Li等[6]将携带CD基因的腺病毒pAd Track-CMV-CD感染细菌，与pAdEasy-1整合，后再感染人胰腺癌细胞系Patu8988和SW1990，然后在这两种细胞系的培养液中中加入5-Fc，所获得的阳性克隆中病毒脂质内的CD基因浓度高达2×1011pfu/ml。张世能等[7]用同源重组技术构建了腺病毒Ad-CD、Ad-GFP和Ad-CD/UPRT，体外感染人胰腺癌细胞SW1990，同时，建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，在瘤体内注射腺病毒进行治疗。结果显示，转染CD/UPRT的胰腺癌SW1990细胞对5-FC的敏感性明显提高,Ad-CD/UPRT组的半数抑制剂量(IC50)为25 μmol/L,而Ad-CD组和Ad-GFP组分别为100 μmol/L和>1000 μmol/L。Ad-CD组、Ad-CD/UPRT组和Ad-GFP组的细胞凋亡率分别为61.3%、40.5%和3.0%,3组间差异有统计学意义。Ad-CD/UPRT瘤内注射治疗后，移植瘤体积缩小81%,Ad-GFP治疗肿瘤致使其缩小63%。作者认为CD/UPRT自杀基因系统能够显著地加速胰腺癌细胞的凋亡。Tang等[8]对胃癌的研究和Kajiwara等[9]对鼻咽癌的研究证实，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(herpessimplex virus thymidine kinase，HSV-tk)基因可催化抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)产生磷酸化反应，通过阻止DNA复制过程发挥细胞毒效应。Luo等、Duarte等[10-11]报道指出，目前HSV-TK基因疗法最常用的药物主要是嘌呤核苷类似物，包括阿昔洛韦(ACV)及其衍生物GCV、潘洛昔非(PCV)和布洛昔非(BCV)，其中GCV最常用。

三、免疫基因治疗

免疫基因治疗就是将各种细胞因子基因导入肿瘤或其他免疫效应细胞，使其在机体表达分泌细胞因子或利用其他基因分子增强肿瘤细胞的免疫原性或免疫系统功能，或应用IL-4基因修饰的胰腺癌疫苗等使机体产生特异性抗体进行免疫基因治疗，以加速肿瘤的消退。Liu等[12]研究表明，gammadelta-T细胞具有先天的抗肿瘤特性， 能够识别并杀死肿瘤细胞， 特别是对上皮细胞起源的恶性肿瘤更为敏感，因此可将其用于治疗上皮细胞起源的胰腺癌。此外，Yang等[13]在小鼠模型中应用转染突变K-ras基因且表面有效表达抗原表位(K-ras-12-Val) 的树突状细胞(dentritic cell， DC)，结果表明治疗组小鼠有更高的存活率和更长的存活时间，且移植瘤的体积更明显缩小[(68±13)mm3比(87±14)mm3和(79±19)mm3，P<0.05]，成为肿瘤免疫基因治疗的新热点。Xu等[14]构建了一种CEA启动子调控的溶瘤腺病毒载体用于动物实验。在人胰腺癌PANC1免疫缺陷的裸鼠移植瘤模型中，CEA启动子调控的腺病毒AdCEAp-HSP70能够显著抑制肿瘤的生长；在大鼠胰腺癌DSL-6A/C1模型中，CD4+、CD8+和gamma/delta T细胞浸润肿瘤细胞，诱导宿主分泌细胞因子TGF-β、INF-γ和IL-6，产生双抗肿瘤作用，完全抑制胰腺癌的生长。作者认为，CEA启动子控制下的溶瘤腺病毒对癌症的基因治疗具有较高的安全性和疗效，具有广阔的应用和发展前景。

四、抗血管形成基因治疗

这种疗法依赖于激活抑制血管生长因子(VEGF)或TNF、p53、PEDF等抑制因子，抑制肿瘤的血管形成和生长，从而抑制肿瘤细胞的生长和存活。Zhu等[15]采用实时PCR检测60例配对胰腺癌组织的HIF-1α、EPAS1和VEGF mRNAs的表达；采用蛋白质印迹法和免疫组化法、过氧化物酶法检测HIF-1α、EPAS1和VEGF蛋白的表达，同时评估微血管密度(MVD)。结果发现胰腺癌组织的EPAS1、VEGF基因表达显著升高，MVD显著增加，EPAS1与VEGF、VEGF与MVD、EPAS1与MAD之间均具有显著的相关性，EPAS1、VEGF的表达与MVD及TNM分期、肿瘤大小显著相关。Elbarbary等[16]研究认为，可溶性重组血管内皮生长因子受体VEGF-Trap可与VEGF紧密结合，显著抑制VEGF的功能，从而使胰腺癌细胞处于缺血状态。Pittella等[17]制备了具有生物相容性的CAP/siRNA混合纳米材料，将携带VEGF的siRNA纳米粒子材料治疗裸鼠皮下BxPC3种植瘤，可抑制种植瘤的生长，并与肿瘤中的siRNA蓄积增强和显著的VEGF基因沉默具有良好的一致性。

五、肿瘤裂解病毒基因治疗

这种疗法基于经改造过的野生型病毒能裂解肿瘤细胞而不会损害正常细胞的机制。Bouvet等[18]应用含野生型p53抑癌基因构建的Ad5/CMV/β-半乳糖苷酶测定6个p53突变体胰腺癌细胞系(AsPC-1、BxPC3、Capan-1、CFPAC-1、MIA PaCa-2和PANC-1)的转染率，结果MIA PaCa-2转染率最高，在MOI50时，其β-半乳糖苷酶染色阳性率高达65%，而CFPAC-1细胞的β-半乳糖苷酶表达率只有15%。腺病毒介导的p53基因以剂量依赖的方式抑制人胰腺癌细胞系的生长。作者认为，通过腺病毒介导野生型p53将p53突变体引入胰腺癌中可诱导细胞凋亡和抑制细胞生长。Hwang等[19]的小鼠动物实验研究表明，逆转录病毒介导的p53基因对鼠原发胰腺癌或转移性胰腺癌的生长具有显著的抑制作用。最新的一些研究[20-22]表明，腺病毒ONYX-015是E1B(55 kDa)基因缺失的腺病毒，而E1B基因与肿瘤抑制蛋白p53结合能阻断p53介导的转录活性已应用于临床，成为胰腺癌治疗的一种新策略。美国Jonaaon综合癌症研究中心2003年报道的I期、II期临床试验[23]结果显示，腺病毒ONYX-015经内镜超声引导注射入21例胰腺癌患者的癌组织内，每2周1次，共4次，治疗后有10例患者的肿瘤体积有缩小或无进展。Caseante等[24]将HIV病毒TAT蛋白上的一个碱性结构域中的8肽与胸苷激酶组合成Tat8-TK/GCV系统，并将其用于体内试验，结果35.6%～50%的肿瘤体积缩小。宰红艳等[25]应用pGCSIL-PUR和pGCSIL-NEO分别构建针对XIAP和survivin的shRNA慢病毒载体，将其感染胰腺癌细胞SW1990和PANC1，经嘌呤霉素和新霉素筛选并扩大培养得到稳定感染株。应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测胰腺癌细胞的XIAP和survivin的表达；MTT法检测细胞增殖和化疗敏感性；测定caspase-3/7活性；DAPI 染色分析细胞凋亡。结果显示，获得XIAP和survivin表达稳定的SW1990和PANC1细胞的增殖均明显减弱，且两种基因有协同抑制作用。虽然它们的细胞凋亡无明显影响，但能明显增加其对化疗药物(5-FU、吉西他滨)的敏感性。此结论为基于慢病毒载体的胰腺癌靶向基因治疗提供了新的思路。

六、受体基因治疗

生长抑素受体SST2能够介导生长抑素产生抗增殖效应，但人胰腺癌组织中无SST2基因表达。国内外学者[26-28]将SST2基因引入人胰腺癌组织并使其稳定表达，从而唤起机体的自分泌反馈环，起到抑制肿瘤细胞增殖的效果。郝昆等[29]应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术建立稳定低表达胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的人胰腺癌PANC1细胞株，并观察其对吉西他滨化疗敏感性的影响。结果显示，吉西他滨对低表达IGF1R基因的PANC1细胞的IC50从(0.774±0.001)mg/L下降到(0.330±0.003)mg/L，即对吉西他滨的敏感性增加了2.35倍。在裸鼠移植瘤模型中，干扰IGF1R基因后皮下移植瘤生长缓慢，联合应用吉西他滨后对肿瘤生长的抑制作用进一步增加。作者认为，慢病毒介导的RNA干扰技术特异性沉默IGF1R基因，能显著增强胰腺癌细胞株PANC1对吉西他滨的敏感性。

七、特异性启动子基因治疗

该疗法利用基因的靶向性传送，将某些相关的特异性启动子导入癌细胞，从而增加其对癌细胞的杀伤效能。刘金龙等[30]实验证实，由Egr-1启动子调控的TK自杀基因在γ射线作用下可以显著提高杀伤胰腺癌细胞的能力。陈俭云等[31]将U6启动子驱动的survivin特异性RNAi质粒载体和阴性对照质粒分别转染PANC1细胞，用RT-PCR 和蛋白质印迹法分别检测survivin mRNA和蛋白的表达。结果显示转染survivin特异性RNAi 载体24 h和48 h后，PANC1 细胞survivin mRNA表达抑制率分别为(52.67±3.51)% 和(75.33±3.06)%，蛋白表达抑制率分别为(58.00±3.61)% 和(76.67±4.73)%。Hendruschk等[32]的研究也得到类似的结果。由此可见，特异性启动子基因治疗或将成为肿瘤治疗领域的新热点。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.025

214400 江苏江阴，东南大学医学院附属江阴医院 肝胆外科

刘双海，Email:liushuanghai@medmail.com.cn

2012-08-06)

(本文编辑：吕芳萍)