应力介导细胞凋亡的研究进展

周佳 综述 李青峰 审阅

应力介导细胞凋亡的研究进展

周佳 综述 李青峰 审阅

应力改变介导的细胞凋亡与许多疾病的发生、发展密切相关，研究该机制可为相关疾病提供预防、治疗的方法。本文就细胞凋亡的基本特点、应力介导细胞凋亡的相关研究、应力模型的建立及凋亡检测的方法等方面进行综述。

凋亡 应力 检测

细胞凋亡（Apoptosis）是由特定基因控制的细胞自主的、有序性的死亡，又称程序性细胞死亡 （Programmed Cell Death，PCD）[1]。外界环境因素改变可以触发细胞内预存的死亡程序，而引发细胞凋亡。细胞凋亡是细胞的基本特征之一，与细胞增殖共同维持机体正常生长发育和内环境稳定。研究应力与细胞凋亡的相关性，可以有效地了解与组织应力改变相关的疾病的发生、发展情况，探索与组织应力改变相关的治疗方法的可行性。本文就细胞应力改变介导的细胞凋亡方面的研究进行综述。

1 细胞凋亡概述

研究证实，细胞凋亡存在两条起始途径：外源性途径和内在途径[2]。外源性途径即死亡受体途径，外界刺激通过细胞膜上的凋亡受体触发细胞凋亡；内在途径又称为线粒体途径，细胞环境改变后，线粒体膜电位改变触发细胞凋亡。两种途径最终均激活caspases-3（半胱氨酸蛋白酶），完成细胞凋亡。细胞应力发生一定程度改变时，胞内的内质网将受力信号传递给线粒体，细胞可以通过内在途径发生凋亡。

1.1 细胞调亡的形态学特征和生物化学改变

典型凋亡细胞的形态学变化过程包括：早期细胞体皱缩，细胞器完整但紧密压缩，核收缩，染色质浓缩于核膜周边，然后核裂解成碎块，胞膜逐渐突起，出芽形成大疱，而后大疱从凋亡细胞表面脱离出来，形成“凋亡小体”，最后凋亡小体被吞噬细胞吞噬，一般不出现炎症反应[3-5]。

凋亡细胞的胞膜成分亦发生改变，在凋亡早期，原来位于细胞膜内侧的磷脂酸酰氨酸（Phosphatidylserine，PS）迁移至脂双层外侧。

细胞凋亡时，核小体间的双链DNA的断裂，导致形成多个180～200 bp，或其整数倍为单位的DNA片段。通过琼脂糖凝胶电泳检测可见特征性梯状带。

1.2 细胞凋亡的调控

细胞凋亡是由多基因控制，在多因素参与下通过复杂的调节网络实现的。目前，对凋亡的调控已经有了一定的了解，在基因的表达层面，促凋亡基因 ced-3、ced-4、c-Myb、c-Myc、p53、MyD118、GADD45、ICE、Bax 等，抑凋亡基因 ced-9、Bcl-2、Bcl-xL、MCL1、MyD116等参与细胞凋亡的调控；在凋亡过程中 Ca2+，pH 值，膜电位等生理信号，TNF-α、INF-γ等细胞因子，Fas、TRAIL、APO-3、caspase 蛋白水解酶家族等因子在其中发挥了重要的作用[6-8]。

2 细胞应力改变与细胞凋亡的相关研究

细胞存活的应力条件将对细胞的凋亡行为产生重要的影响，近年来随着生物学家对这一问题的关注，细胞应力与细胞凋亡的相互作用关系已逐步得到揭示。Fong等[9]采用应力模式化培养的颅骨成骨细胞来控制细胞的形态和面积，研究结果表明成骨细胞的凋亡率随着铺展面积的增大而降低。细胞的活性受面积的影响，同时细胞的铺展形态也有重要的调节作用。郭子义等[10]研究了动脉血流切应力变化对血管平滑肌细胞（Vascula smooth muscle cells，VSMC）凋亡的影响，结果显示零应力条件下VSMC的凋亡和去分化明显增加。Sotoudeh等[11]报道在高血压条件下可引起死亡受体的聚集，从而导致VSMC的凋亡。胡佳等[12]指出，流体剪切力达到40 cmH2O时影响血管内皮细胞的增殖和凋亡进程并有一定时相性的变化规律，同时P53、Bcl-2与Fas蛋白在凋亡发生发展中的不同时期起到相应的调控作用。佟俊杰等[13]的实验证实了周期性张应力能导致牙周成纤维细胞凋亡的发生，从而为临床咬牙合创伤即咬牙合力造成牙周损害疾病的预防和治疗提供了理论依据。Hawwa等[14]通过实验证实，肺成纤维细胞在周期性牵引力的作用下，凋亡现象较对照组增加3倍以上。Lo等[15]在包被胶原并有硬度梯度的聚丙烯酰胺片上培养3T3细胞，发现3T3成纤维细胞可以探测出基底的硬度并作出响应；当细胞从软基底区域进入硬基底区域时，细胞会转向90°，其迁移的速度会瞬时增加，细胞铺展面积增加。从以上论述可见，细胞应力条件对细胞凋亡的行为有着重要的影响，并为各种临床疾病的预防、治疗提供理论指导。

3 应力作用模型

1975年，Rodan等用软骨和骨细胞进行流体静压加载，开创了机械应力应用于细胞和组织研究的方法。随后的研究中，出现了多种多样的装置用于构建受力模型[16-17]。

3.1 压应力作用模型

3.1.1 重物加力法

重物加力法是将重物直接对培养的细胞和组织加力的方法，通过改变物体的重量调节施加压应力的大小。该加力方法产生持续性静压力。

3.1.2 液压加力法

液压加力法是利用流体静压对在体外培养的细胞和组织加力的方法，应用高压装置或减压装置改变培养液对细胞和组织产生的静压力大小。包括正压与负压两种方式。流体静压作用培养细胞和组织的研究模型设备简单，刺激均匀，易于传导静止或短时的应力。

3.1.3 离心加力法

离心力也被认为是一种压应力。有学者用水平微板转盘对培养的细胞施加离心力。离心加力法通过调节旋转半径、转速来改变加力大小，可以产生持续性或间歇性压力[18]。

3.2 牵张力作用模型

目前，牵张力主要是由基底形变加力模型产生，使用最广的是以基底形变为基础的加力装置。其基本原理是通过基底弯曲变形或水平拉伸使附着于基底生长的细胞被拉伸或压缩。1991年，Andersen等最早报道了用“圆顶”造成基底形变，对细胞施加最大1%双轴张应变的方法。

3.2.1 平面外牵拉基底变形的应力作用模型

平面外牵拉基底变形的应力作用模型是通过基底弯曲变形来产生牵张力的模型。

3.2.1.1 单向牵拉弹性膜片变形应力作用模型

最初有学者在矩形的基底下放置半圆形支架，形成基底的形变，产生牵张力。近年来出现了四点弯曲模型，利用呈矩形的四个着力点，垂直对基底加力，基底形变产生牵张力。单向牵张力发生模型稳定，尤其适用于有方向性应力要求的细胞和组织的研究[19]。

3.2.1.2 非单向牵拉弹性膜片变形的应力作用模型

当基底是圆形时，将力垂直作用于基底，基底形变产生的牵张力是多方向的。目前最常用的装置是利用负压吸引形成基底形变。随着装置的不断改进，该作用模型产生的牵张力稳定、精准，操作便捷，但仍存在基底受力不均的缺点[20]。

3.2.2 平面作用牵拉基底变形的应力作用模型

平面作用牵拉基底变形的应力作用模型中，细胞培养的基底放置在一个平台上，基底的四周与牵拉装置相连，例如Flexcell系统通过负压使弹性膜边缘拉伸，改变其长度形成基底的牵张力。通过调节弹性底面的水平形变量，控制细胞受力的大小和方向。可以产生单向牵张力、双向牵张力。如果平面基质是圆形的，在中央圆形基底部位的膜即受到各个方向均匀的牵张力[21]。

3.3 流体切变应力模型

其原理是使用流体切变应力对细胞进行作用。包括两种装置：锥体-平面系统，通过调整锥体的形状与旋转锥体的角速度获得流体切变力；另一种装置则称为平行平板流动槽，利用装置入口与出口的压力变化来改变流体切变率，通过调整装置的尺寸以及比例获得多种流体切变参数[22]。

4 细胞凋亡的检测方法

4.1 电子显微镜细胞形态学检测

透射电镜和扫描电镜下可以观察到凋亡细胞的超微结构特征的改变。此方法是定性凋亡细胞的可靠方法，为细胞凋亡形态学观察的金指标。

4.2 细胞生化检测

DNA Ladder带检测，细胞凋亡时，由于DNA被裂解成单个核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的180～200 bp DNA阶梯状条带。

由末端脱氧核糖核酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT）介导的 dUTP 缺口末端标记技术（TUNEL），是原位末端标记法（In Situ End-Labeling，ISEL）中的一种。其基本原理是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。即将荧光素或同位素标记的dUTP接到断裂DNA的3'-0H端发生聚合反应，然后进行检测[23]。

线粒体膜电位的降低是凋亡细胞早期的特征性改变，发生在形态学改变之前，且被认为是不可逆的。由于线粒体膜电位的存在，能使一些亲脂性的阳离子荧光染料与线粒体的基质相结合，这些染料如罗丹明123、JC-1等与线粒体的基质结合可以用来检测线粒体膜电位的变化[24]。当细胞MMP降低时，其荧光强度降低，也就是说线粒体基质的荧光增强或减弱能说明线粒体内膜电负性增强或降低。

4.3 免疫学检测方法

免疫组化广泛应用于凋亡细胞的基因表达、细胞内各因子水平和蛋白质含量等的分析。

4.4 流式细胞仪检测

流式细胞仪不仅可以从形态上分析细胞是否存在凋亡，还可从染色质、离子、蛋白等多方面检测细胞凋亡[25]。

碘化丙啶（Propidum iodide，PI）染色法DNA含量测定，PI荧光染料分子不能进入完整的细胞膜，但细胞经固定、打孔后PI可直接进入细胞，插入到DNA碱基对之间，流式细胞仪通过检测掺入的PI荧光强度来显示DNA含量。凋亡细胞DNA含量降低，故在正常的G0/G1峰前有一亚G0/G1峰出现，即为凋亡峰（AP峰）。

膜联蛋白法：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。膜联蛋白（Annexin V）是一种分子量为35～36 KDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将膜联蛋白V进行荧光素标记，以标记了的膜联蛋白V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

4.5 分子探针检测

分子探针在分子影像学中是指对某一特定生物分子（如蛋白质、DNA、RNA）具有特异性靶向的、并能够进行体内或/和体外示踪的标记分子，这些标记分子能够在体内或/和离体反映其靶生物分子的量或/和功能，通常由信号组件和亲和组件两部分组成[26－27]。在细胞凋亡的分子成像研究中，根据信号组件的成分可分为放射性核素、荧光素、含荧光基团标记的分子探针。凋亡研究的亲和组件有两种：以Caspase为靶标的凋亡影像探针和以Annexin V亲和组件为靶标的凋亡探针。

细胞形式的凋亡检测适用于以上各种类型的检测方法。组织形式的凋亡检测可采用电镜检测、TUNEL法。分子影像技术可用于在体凋亡检测。

5 展望

应力条件下细胞凋亡行为的改变与多种临床疾病相关。在整形外科领域，牵拉颅面骨获得增生的骨质、应用软组织扩张器获得额外的皮肤，这些以机械力刺激组织再生的技术已在临床中广泛应用，但作用机理的研究仍不够完善。在这些机械力刺激组织再生的现象中，应力介导凋亡状态改变也是必要的研究内容之一。分子探针提供了一种在体研究的凋亡检测手段。分子影像学也以一种全新的科学观察方法即非侵入性的方式，实现对活体内参与生理和病理过程的分子进行定性或定量的可视化分析，为细胞凋亡成像研究引入了新的思维方式和研究手段。

[1]Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J].Br J Cancer,1972,26(4):239-257.

[2]Giansanti V,Torriglia A,Scovassi AL.Conversation between apoptosis and autophagy:"Is it your turn or mine"[J]?Apoptosis,2011,16(4):321-333.

[3]Hacker G.The morphology of apoptosis[J].Cell Tissue Res,2000,301(1):5-17.

[4]Telford WG,King LE,Fraker PJ.Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometry[J].Cytometry,1992,13(2):137-143.

[5]Fadok VA,Voelker DR,Campbell PA,et al.Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recongnition and removal by macrophages[J].J Immunol,1992,148(7):2207-2216.

[6]Kim MO,Moon DO,Choi YH,et al.Platycodin D induces mitotic arrest in vitro,leading to endoreduplication,inhibition of proliferation and apoptosis in leukemia cells[J].Int J Cancer,2008,122(12):2674-2681.

[7]Yao J,Jiang Z,Duan W,et al.Involvement of mitochondrial pathway in triptolide-induced cytotoxicity in human normal liver L-02 cells[J].Biol Pharm Bull,2008,31(4):592-597.

[8]Raff M.Cell suicide for beginners[J].Nature,1998,396(6707):119-122.

[9]Fong KD,Song HM,Nacamuli RP,et al.Apoptosis in a rodent model of cranial suture fusion:in situ imaging and gene expression analysis[J].Plast Reconstr Surg,2004,113(7):2037-2047.

[10]郭子义,严志强,张明亮,等.血流切应力变化导致颈总动脉重建及其对血管平滑肌细胞凋亡和分化的影响[J].医用生物力学,2008,23(1):61-65.

[11]Sotoudeh M,Li YS,Yajima N,et al.Induction of apoptosis in vascular smooth muscle cells by mechanical stretch[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,282(5):1709-1716.

[12]胡佳,郭应强,张尔永,等.流场压力变化对体外培养内皮细胞增殖和凋亡及其相关蛋白的影响[J].生物医学工程学杂志,2009,26(4):837-841.

[13]佟俊杰,袁晓,张月,等.周期性张应力对成纤维细胞凋亡的影响及其调控机制[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(33):6108-6112.

[14]Hawwa RL,Hokenson MA,Wang Y,et al.IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch[J].Pediatr Pulmonol,2011,46(7):640-649.

[15]Lo CM,Wang HB,Dembo M,et al.Cell movement is guided by the rigidity of the substrate[J].Biophys J,2000,79(1):144-152.

[16]Lee AA,Delhaas T,Waldman DA,et al.An equibiaxial strain system for cultured cells[J].Am J Physiol,1996,271(4 Pt 1):1400-1408.

[17]Brown TD.Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro:a review[J].J Biomech,2000,33(1):3-14.

[18]Buckley CT,Thorpe SD,Kelly DJ.Engineering of large cartilaginous tissues through the use of microchanneled hydrogels and rotational culture[J].Tissue Eng Part A,2009,15(11):3213-3220.

[19]Owan I,Burr DB,Turner CH,et al.Mechanotransduction in bone:osteoblasts are more responsive to fluid forces than mechanical strain[J].Am J Physiol,1997,273(3 Pt 1):810-815.

[20]赵志河,李宇.正畸牙移动细胞生物力学研究进展[J].医用生物力学,2010,25(6):393-398.

[21]Colombo A,Cahill PA,Lally C.An analysis of the strain field in biaxial Flexcell membranes for different waveforms and frequencies[J].Proc Inst Mech Eng H,2008,222(8):1235-1245.

[22]Standley PR,Cammarata A,Nolan BP,et al.Cyclic stretch induces vascular smooth muscle cell alignment via NO signaling[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002,283(5):1907-1914.

[23]崔巍,唐炳华,王硕仁.细胞凋亡检测方法探讨[J].细胞生物学杂志,2007,29(5):777-782.

[24]Ravagnan L,Roumier T,Kroemer G.Mitochondria,the killer organelles and their weapons[J].J Cell Physiol,2002,192(1):131-137.

[25]娜仁图娜拉,闫雷,赵瑞杰,等.流式细胞术及其在细胞凋亡检测中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(27):5353-5356.

[26]唐敏,曾文彬,曹亚.分子探针在细胞凋亡检测中的研究进展[J].中国生物工程杂志,2011,31(6):124-128.

[27]Nunn AD.The cost of developing imaging agents for routine clinical use[J].Invest Radiol,2006,41(3):206-312.

Research Progress of Stress-induced Apoptosis

ZHOU Jia,LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.

LI Qingfeng(E-mail:liqfliqf@yahoo.com.cn).

Apoptosis;Mechanical stress;Detection

Q255

B

1673－0364（2012）04－0235－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.016

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

李青峰（E-mail：liqfliqf@yahoo.com.cn）。

【Summary】Mechanical stress-induced apoptosis,as programmed cell death,is often correlated with many diseases.Research of mechanical stress-induced apoptosis could provide the prevention and therapy of relative diseases.In this review,the basic features of apoptosis,relative research of stress-induced apoptosis,the establishment of the strain model and the methods of cell apoptosis detection are all reviewed.The research direction of stress-induced apoptosis is also proposed.

2012年4月12日；

2012年5月7日）