间充质干细胞成骨性能的影响因素

谢方南 综述 康宁 肖苒 审校

间充质干细胞成骨性能的影响因素

谢方南 综述 康宁 肖苒 审校

间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）因高度的自我增殖与多向分化能力在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景。目前，MSC成骨分化的研究很多，但体外、内的成骨效率仍然较低。因此，提高MSC的成骨性能成为关注热点。MSC成骨性能受多方面因素的影响，我们从细胞来源、分离纯化、诱导策略及血管化等4个方面对影响MSC成骨性能的因素进行综述。

间充质干细胞 组织工程 细胞来源 分离纯化 诱导策略 血管化

组织工程技术为临床大面积骨缺损的修复提供了新的思路。然而，在基于MSC的组织工程骨缺损修复过程中，MSC的成骨效果并不理想，主要表现为MSC体内、外的成骨效率较低。MSC的成骨性能受多方面因素的影响，本文从细胞来源、分离纯化、诱导策略及血管化四个方面对MSC成骨性能的影响作如下综述。

1 细胞来源对MSC成骨性能的影响

MSC可来源于体内的多种组织，如骨髓、脂肪、肌肉、肝脏、外周血、脐带、胎盘等，组织来源的不同及供者年龄的差异均会影响其成骨性能。

Pascale等[1]将胎儿骨髓、外周血、肝脏等3种不同组织来源的MSC进行比较，发现骨髓来源的MSC成骨性能最强，外周血来源次之，肝脏来源最弱。Pilz等[2]比较了胎盘、骨髓来源的MSC表面抗原和成骨分化能力，结果显示骨髓来源MSC的CD146和碱性磷酸酶（ALP）表达水平显著高于胎盘来源MSC，表现出更高的成骨性能。另外，对脐带血、脂肪、骨髓等组织来源MSC的成骨性能的比较研究，证实了骨髓来源MSC表现出最高的成骨性能，而脂肪组织来源MSC成骨性最低[3]。

针对39名37～86岁男性骨髓MSC成骨性的比较研究，发现人骨髓MSC成骨性能随着年龄增加而逐渐降低[4]。Zhang等[5]研究了年龄对C57BL/6鼠骨髓MSC成骨分化性能的影响，发现18周龄以后的C57BL/6鼠其MSC数量与成骨分化能力会随着年龄增长而显著下降。Zhou等[6]也报道了17～90岁骨髓捐献者骨髓MSC成骨性能的变化，发现STRO-1+MSC细胞数量，随着年龄的增长而显著减少，成骨相关基因（RUNX2、OSTERIX、ALP、BSP、OC） 的表达以及 ALP 活力明显降低。

骨髓来源的MSC在骨缺损修复过程中应用最为广泛。老年患者的骨髓内MSC数量明显减少、抗氧化能力下降、衰老细胞增多，但增殖分化能力并没有明显改变，而且适当刺激仍具有较强的迁移能力。因此，有人提出应增强其向损伤部位的归巢能力以促进修复[7]。

2 分离纯化对MSC成骨性能的影响

目前，大多数研究主要利用MSC贴壁生长的特性对其进行分离纯化。这种方法得到的MSC存在高度异质性，其中包括胚胎样细胞、MSC以及不同程度的定向分化细胞群。不同亚群的细胞具有不同的增殖和分化潜能，其中生存寿命较短、成骨性能较差的细胞将会影响最终的成骨效率。

为了获取成骨性能优良且生存时间较长的MSC亚群，有研究针对分离方式进行了改进。Liu等[8]将第2代鼠骨髓MSC悬液与二氧化硅颗粒共培养1 h后，利用密度梯度离心法分离出一类高度纯化并具有较强成骨分化潜能的MSC亚群（M2），在体外成骨诱导28 d后，96%的M2细胞能合成骨钙素，ALP活性动态升高并伴有明显的骨基质钙化；M2细胞同种异体异位成骨实验发现，移植12 d后，可以在组织学水平检测到ALP、骨桥蛋白、骨钙素以及局部基质的钙化。Rada等[9]用包被不同抗体（CD29、CD44、CD49d、CD73、CD90、CD105、p75以及STRO-1）的免疫磁珠颗粒，从人脂肪MSC中分选出不同的细胞亚群，发现用抗STRO-1的免疫磁珠分选出的细胞亚群成骨能力最高，抗CD90、抗CD49d以及抗p75分选出的细胞也具有较高的成骨分化能力。此外，对流离心洗脱法可在原代人脐带MSC中分离出一种细胞直径在11 μm左右的细胞群，流式细胞分选发现这种细胞群高表达CD44、CD73、CD90及CD105等干细胞标记物，并且比其他细胞亚群更年轻、增殖能力更强，有可能成为另一应用前景广阔的MSC 来源[10]。

用这些方法都能使MSC成骨性能得到一定程度的提高，但是由于目前仍然缺乏MSC及其定向分化的特异性标志物，MSC及不同亚群的分离纯化技术仍未取得突破性进展。

3 诱导策略对MSC成骨性能的影响

基于MSC的骨缺损治疗，有研究认为，适当的体外诱导可促进MSC的体内成骨效率[11－12]。根据骨发生过程中膜内成骨和软骨内成骨两种方式，对MSC体外诱导主要有成骨诱导与成软骨诱导两种策略。

3.1 成骨诱导

研究发现，将成骨细胞接种于陶瓷支架可使其通过膜内成骨的方式生成骨组织[13]。因此，通常在体外对MSC成骨诱导2～3周，使其转化为稳定成骨表型之后，再应用于组织工程骨的构建。Eslaminejad等[14]将犬MSC体外成骨诱导3周后，进行光学和透射电镜观察，并检测ALP及软骨相关基因的表达，镜下可见很多类似于板层骨结构的骨结节样细胞团，表面覆盖一层骨膜样结构，细胞团中发现不同形态的类骨细胞以及垂直排列的胶原纤维束，但未检测到软骨相关基因的表达。

3.2 成软骨诱导

研究表明，未经诱导的MSC植入体内后也可通过软骨内骨化的方式成骨[13]。因此，适当的体外成软骨诱导可能会有助于软骨内骨化的发生。Janicki等[15]对人骨髓MSC体外成软骨诱导促进软骨内成骨的方式进行了研究。他们将MSC种植在β-TCP支架上，其中一组复合物经过体外成软骨诱导6周后植入裸鼠皮下，另一组未经任何诱导后植入。植入8周后组织学检测发现：未经诱导的MSC/β-TCP复合物表现出膜内成骨的现象，未发现骨髓样组织；而经过成软骨诱导的MSC/β-TCP复合物体外形成了富含Ⅱ型胶原和蛋白多糖的软骨样组织，皮下移植后形成了大量的异位骨，通过原位杂交技术进一步发现新生骨主要是由供者MSC产生，且发现有来源于受体鼠的骨髓结构形成。有研究进一步证实了MSC体外成软骨诱导能促进软骨内骨化的发生[16－17]。Scotti等[18]认为MSC向肥大软骨细胞转化，是软骨内骨化发生的一个必要过程，在体外将MSC诱导成肥大软骨细胞能显著促进其体内软骨内骨化过程。此外，Farrell等[19]认为MSC通过软骨内成骨的方式更有利于新生骨组织的血管化。

MSC体外成骨与成软骨诱导均可促进其体内成骨，但是两种方法成骨效率的比较，仍有待于进一步研究。

4 血管化对MSC成骨性能的影响

在组织工程骨修复缺损的过程中，充足的血液供应能为骨缺损部位微环境提供大量的成骨祖细胞、信号分子以及营养供应，同时能带走代谢废物与各种降解产物，有助于建立良好的再生微环境。而MSC支架材料复合物植入后能否成功地介导骨生成主要取决于MSC的生物学活性，血液供应不足将会影响其增殖、分化及分泌功能，导致成骨量降低。因此，血管化在MSC成骨过程中至关重要。目前主要通过血管内皮细胞、血管生成因子以及外科手段血管预置等方法，来促进MSC成骨过程中的血管化。

4.1 血管内皮细胞

血管内皮细胞是目前研究最多的血管生成细胞，大量的研究报道显示，血管内皮细胞能与不同组织来源的MSC体外共培养生成血管样结构。Verseijden等[20]将人脂肪MSC与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以2:8比例进行三维共培养，成功地实现了脂肪MSC支架复合物体外预血管化，植入裸鼠皮下明显提高了新生血管形成的数量，并且能整合至宿主血管系统。

在人骨髓MSC与HUVECs共培养的过程中发现，内皮细胞不仅能促进血管生成，而且能使MSC成骨标记物ALP的活性提高4倍以上[21]。Liu等[22]将人脐静脉内皮细胞与成骨诱导后的人骨髓MSC以1:1进行共培养，结果表明，脐静脉内皮细胞能显著增强骨髓MSC的成骨矿化能力。Saleh等发现，HUVEC条件培养基（HUVEC-CM）能够显著提高人骨髓MSC中ALP的表达水平、矿化结节的数量以及成骨相关标志基因ALP、BMP-2、ON与OPN的表达水平，并且在HUVEC与人骨髓MSC三维共培养的实验中证实了这种成骨促进作用，并发现成骨诱导培养条件下HUVEC能增强pSmad 1/5/8的表达水平，激活骨形态发生蛋白（BMP）信号通路，促进骨生成。

脐静脉内皮细胞是多数研究中主要的血管内皮细胞来源，然而与宿主的免疫不相容性，使其很难进入临床应用。因此，有研究认为，自体脂肪组织来源的微血管内皮细胞和外周血来源的内皮祖细胞，有可能成为新的内皮细胞来源[23-25]。

4.2 血管生成因子

血管内皮生长因子 （VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）是两个强有力的血管生成促进因子[26－27]，对MSC血管微环境的形成至关重要。Huang等[28]在基于骨髓MSC骨组织再生的研究中发现，加入VEGF后能显著增加新生血管的生成及骨组织形成量。Singh等[29]将外源性的VEGF结合至胶原包被的聚已酸内酯（PCL）支架，结果显示，VEGF对支架植入后早期血管生成有显著促进作用。VEGF与PDGF不仅能增加新生血管形成而且还能对MSC的增殖、分化等进行调节。Alimonte等[30]发现VEGF能促进人牙髓MSC的体外增殖以及成骨分化性能。Caplan等[31]认为PDGF一方面通过增强MSC对成骨因子BMP等的敏感性来促进MSC成骨分化，另一方面通过刺激血管周细胞分泌VEGF来促进血管生成，更可诱导血管周细胞对新生血管的再贴附，具有稳定新生血管的作用。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在基于MSC的骨再生过程中也具有促进骨生成及血管化的作用[32－33]。Jiang等[34]用bFGF基因转染的骨髓MSC注入至经成骨牵引的新西兰兔下颌骨牵引间隙中，发现bFGF转染的骨髓MSC成骨量、骨密度以及骨矿物含量显著高于对照组。Chen等[35]认为bFGF能增高成骨分化因子及ALP的mRNA表达水平，促进MSC体内成骨量及血管化水平。

VEGF、PDGF及bFGF等血管生成因子在促血管、促成骨方面的作用已经得到认可，但在应用过程中很难控制释放的稳定性。因此，寻找合适的支架材料来介导其在特定的时空内稳定释放成为了新的难题。

4.3 血管预置

为了使组织工程复合物得到更好的血液供应，有研究提出用外科手段进行血管预置，以促进血管化进程。Cai等[36]以隐静脉为蒂，使其紧贴于BMSC-珊瑚羟基磷灰石（CHA）支架复合物表面，以达到预血管化目的。手术植入4周后检测发现，BMSC-CHA复合物中形成了规则的血管网络，且前3个月成骨总量比未血管化组高1倍。Zhao和Kawamura等[37-38]分别使桡动静脉与隐动静脉从BMSC支架复合物中间穿过，并将其远端结扎，成功将其预血管化，并发现这种血管预置方法能明显促进支架中血管的长入，增强骨缺损的修复效果，提高BMSC支架复合物ALP的活性及骨钙素的含量。此外，有研究发现，用动静脉环路的方法预置血管，也能增强组织工程复合物中血管的长入，提高MSC最终的成骨效果[39]。

血管预置的方法能明显促进组织工程血管化及骨组织的生成，对临床大面积骨缺损的修复意义重大。各种血管预置的方法，如动静脉束、动静脉束末端结扎、动静脉环路等均具有促血管生成的作用，但提高MSC成骨性能及骨缺损修复能力仍有待进一步探讨。

MSC是骨缺损修复中重要的种子细胞，骨缺损治疗的最终效果由影响MSC成骨的各种因素共同决定。根据需求选择最佳种子细胞来源、优化的MSC分离纯化方式、恰当的体外扩增及诱导方案，以及体外、体内血管化的建立和维持等均会影响MSC最终的成骨效果。

未来的研究方向主要有探索具备优良成骨性能MSC亚群的特异性标志物、建立高效纯化的分离方式、综合利用影响MSC成骨性能的各种因素模拟其成骨发育微环境，使之充分发挥自身的成骨性能，为提高临床基于MSC的骨缺损治疗效果提供理论基础及优化方案。

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Influence Factors on Osteogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells

XIE Fangnan,KANG Ning,XIAO Ran.Research Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.

XIAO Ran(E－mail:xiaoran@pumc.edu.cn).

Mesenchymal stem cell;Tissue engineering;Cell source;Isolation and purification;Induction strategy;Vascularization

Q813.1+2

B

1673－0364（2012）04－0225－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.013

国家自然科学基金面上项目（30871433，31071305）。

100144 北京市 中国医学科学院整形外科研究所。

肖苒（E－mail:xiaoran@pumc.edu.cn）。

【Summary】Mesenchymal stem cell(MSC)has broad prospects in the field of regenerative medicine and tissue engineering due to its highly self-renewal and multi-lineage differentiation ability.Although there are many researches about MSC osteogenic differentiation,its osteogenic efficiency is still very low both in vitro and in vivo.Therefore,how to improve the MSC osteogenic performance has become the focus of researchers.MSC osteogenic performance is influenced by many factors.In this review,the influence factors are discussed from four aspects:cell sources,approaches of isolation and purification,induction strategies and vascularization.

2012年5月29日；

2012年7月2日）