NO-cGMP信号途径在干细胞诱导分化中的作用

魏磊鑫 综述 王擎 刘芳 审校

NO-cGMP信号途径在干细胞诱导分化中的作用

魏磊鑫 综述 王擎 刘芳 审校

一氧化氮-环磷鸟苷（Nitric oxide–cyclic guanosine monophosphate，NO－cGMP）信号途径介导了机体内各系统的重要生理功能的实现。大量研究表明，NO-cGMP信号通路在干细胞向心肌细胞、神经细胞等的诱导分化中发挥重要的作用。此外，NO-cGMP信号通路还能促进神经轴突的延伸。本文就NO-cGMP信号途径在胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs)、间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）、神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）等诱导分化中的作用进行综述。

一氧化氮-环磷鸟苷 信号途径 干细胞 诱导 分化

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是一个2价的游离自由基，也是哺乳动物体内重要的信号分子。NO对其下游分子的调节表现为环磷酸鸟苷（3’,5’-cyclic guanosine monophosphate,cGMP）依赖和非依赖两种方式。前者受可溶性鸟苷酸环化酶（Soluble guanylyl cyclase，sGC）的调节，后者通过与金属复合物、氧以及超氧阴离子的相互作用来调节下游事件的发生。NO在细胞内由一氧化氮合酶（Nitric oxide synthases，NOSs）催化生成，目前已知有3种形式的一氧化氮合酶：NOS-1，即神经元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS），主要分布于外周和中枢神经系统的神经元中，有调节血压、舒张血管、松弛平滑肌等作用；NOS-2，即诱导型一氧化氮合酶（Inducible NOS，iNOS），广泛分布于肝、心肌、血管平滑肌细胞等，参与炎症反应；NOS-3，即内皮型一氧化氮合酶（Endothelial NOS，eNOS），主要表达于内皮细胞，发挥扩张血管、抑制血小板聚集、抗动脉粥样硬化等多种血管保护作用[1]。此外，NO还调控着轴突的生长方向、突触的可塑性、神经元的存活和神经前体细胞的增殖分化等[2]。本文拟对NO-cGMP信号途径相关分子在干细胞诱导分化中的作用及应用前景进行综述。

1 NO-cGMP信号途径相关分子

NO-cGMP信号途径相关分子主要有NO、sGC、环核苷酸磷酸二酯（Cyclic nucleotide phosphodiesterases，PDEs）、cGMP、蛋白激酶G（Protein kinase G，PKG）等。sGC是体内唯一已知的NO受体，是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体，目前共发现4种亚型，其中仅α1/β1和α2/β1两种亚型能被NO激活。sGCα1/β1广泛表达于哺乳动物的组织中，在心、脾、肺、脑等组织中表达浓度高，而sGCα2/β1仅在脑组织中高表达[3-5]。PDEs是细胞内第二信使cAMP和cGMP的催化水解酶，主要发挥调节细胞内信号的作用[6]。cGMP是细胞内重要的环核苷酸类第2信使，受sGC和PDEs的双向调节：sGC催化cGMP的产生，而PDEs可以降解cGMP，使其恢复到基础水平，从而降低或终止cGMP的作用。cGMP通过激活cGMP依赖性PKG而发挥作用[7]。PKG是广泛存在于真核细胞内的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其活化后可使多种蛋白质底物发生磷酸化，改变其活性状态，进而发挥生物学效应[8]。

2 NO-cGMP信号途径相关分子在干细胞诱导分化中的作用

2.1 对胚胎干细胞诱导分化的作用

Krumenacker等[9]在未分化胚胎干细胞中发现其NOS-2、sGCα1和PKG的表达很低甚至不表达，但当胚胎干细胞分化数天后可检测到NOS-2 mRNA的表达，7～10 d后NOS-3的表达升高，在胚胎干细胞分化过程中 sGCα1、sGCβ1和PKG的表达都逐渐升高。对sGC活性的分析显示未分化细胞中NO未能刺激cGMP的生成，而分化的胚体细胞经NO作用后却可产生丰富的cGMP。由此表明，NO-cGMP信号途径相关分子在未分化的胚胎干细胞中作用很小，而在胚胎干细胞的早期分化和胚胎干细胞来源细胞的生理过程中发挥重要作用。

2.1.1 诱导胚胎干细胞向心血管细胞的分化

Mujoo等[10]研究显示，cGMP的同源物8-bromo-cGMP可激活PKG而引起干细胞的分化；变构的sGC激动剂BAY41-2272和YC-1能显著提高心肌特异转录因子和蛋白的表达；NO供体和sGC激动剂的单独应用可促进胚胎干细胞向心肌细胞的分化，联合应用可进一步促进心肌特异标志物的表达。Mobley等[11]在胚胎干细胞中加入特异性的PKG抑制剂后，发现有更多的胚胎干细胞分化为心肌细胞。Kanno等[12]研究发现，NOS基因的转入或外源NO的处理均可使心肌特异的基因及蛋白表达显著增高，从而诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化：培养7 d时，肌钙蛋白 T的表达率为（45.6±20.6）%，对照组仅为（9.25±1.77）%；2周内，胚体中跳动心肌的数目和大小都有所增加；电镜及免疫细胞化学显色结果显示，NO诱导后细胞呈现出心肌的形态学特征，其中69%的转NOS基因胚体出现自发性搏动，NO供体处理的胚体则有45%的比例，而对照组却只有约15%的比例。

2.1.2 诱导胚胎干细胞向神经细胞的分化

新近的研究表明，NO－cGMP信号途径还能促进胚胎干细胞向神经细胞的分化。Li等[13]发现人胚胎stage 1干细胞有24.3%的细胞共表达神经干细胞标志物nestin和nNOS，维甲酸（RA）的加入可以提高nNOS阳性细胞率至33.9%，RA联合cGMP后nNOS阳性细胞又增至45.4%。可见RA或RA合并cGMP能促进nNOS阳性神经元的分化效率，NO－cGMP信号途径有利于人胚胎干细胞来源的神经前体细胞的发育，并促进其向功能性神经元的分化。Gómez-Pinedo等[14]认为，cGMP调节的NO信号途径在胚胎干细胞向神经元的早期分化过程中可能发挥重要作用，PDE抑制剂Sildenafil可在体内诱导脑内神经干细胞分化为神经元。

2.2 对不同来源间充质干细胞诱导分化的作用

间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，MSCs广泛分布于各种不同的组织中，如骨髓、牙周组织和脂肪等，MSCs具有向成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经（前体）细胞等细胞分化的多向分化潜能，NO-cGMP信号途径在其中也发挥着重要作用。

2.2.1 对骨髓来源间充质干细胞分化的作用

细胞内NO－cGMP水平的变化可以调节骨髓来源干/前体细胞的分化。Aicher等[15]研究发现，eNOS敲除小鼠的骨髓干细胞和前体细胞的活力受损，继而可能影响到新生血管的形成。与此同时，eNOS敲除小鼠体内由造血干细胞生成内皮祖细胞的能力大大减弱，当遭受缺血损伤时，组织再血管化能力丧失。

Chu等[16]的研究显示，经NO供体DETA-NONOate或硝普钠处理48 h后，成鼠骨髓多能前体细胞（MAPCs）Oct-4 mRNA和蛋白的表达显著提高了68%，细胞的增殖力下降了3倍以上，同时检测到14 d时MAPCs向内皮分化的细胞vWF的表达明显升高。这些作用并不受GC抑制剂或cGMP同源物8-Br-cGMP的影响，说明NO对MAPCs的多能性及分化的调节为cGMP非依赖途径。

催产素可激活NO-cGMP信号途径、诱导猪BMSCs向心肌类型的细胞分化并促进细胞的增殖。Ybarra等[18]研究发现，经催产素处理后细胞的NOS基因和蛋白表达均升高，而经NOS抑制剂L-NAME或/和sGC抑制剂ODQ作用后，心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的转录和蛋白的表达均明显减少，其中ODQ的作用更明显，心肌肌钙蛋白Ⅰ和肌凝蛋白重链均减少，且催产素引起的细胞增殖效应为NOS/sGC抑制剂所阻断。

2.2.2 对牙周组织来源间充质干细胞分化的作用

牙周膜韧带细胞具有成骨细胞的特性，Orciania等[19]研究发现，在牙周膜来源的间充质干细胞分化为成骨细胞的过程中，细胞内钙离子和NO的浓度增高，提示局部合并NO供体作用于体外扩增的牙周膜细胞，可能是治疗牙周缺损的一个理想方法。

2.2.3 对脂肪来源间充质干细胞分化的作用

脂肪来源的间充质干细胞（ADMSCs）中，NO供体SNAP和DEA/NO可以同时激活cGMP依赖和非依赖途径。Rebelatto等[20]研究发现，未处理的ADMSCs表达一些肌细胞的标志物，NO产生的中间产物可引起ADMSCs心肌功能基因的表达。SNAP可增加ADMSCs一些肌细胞标志物和VEGF的表达，提示经SNAP处理的细胞可能具有更好的效果。Berardi等[21]将SNAP预处理的ADMSCs移植至大鼠梗死的心肌，30 d后与未处理细胞移植组相比，射血分数有显著改善，免疫组织化学染色结果显示在预处理ADMSCs移植组，梗死区内发现有肌钙蛋白T–C、vWF等表达的升高。SNAP的处理可引起细胞内S-nitrosation的表达，GSH/GSSG比降低，但cGMP水平不升高。可见SNAP改变了ADMSCs的氧化还原环境，可能与其分化前状态有关联，这一改变可能促进移植后心肌功能的恢复。

2.3 对神经干/前体细胞诱导分化作用

2.3.1 对神经干细胞诱导分化的作用

脑发育过程中，cGMP的减少可降低干细胞向神经元的分化能力，却增强其向非神经元方向的分化能力。Gomez-Pinedo等[14]以NOS抑制剂L-NAME处理孕鼠，使得胎鼠脑内的cGMP减少至对照鼠的46%，大鼠孕14 d前额皮质干细胞来源的神经元的数目减少到对照组的61%，合用PDE抑制剂Sildenafil处理后，神经元的分化趋于正常，L-NAME的处理不减少BrdU标记细胞的总数，也说明了L-NAME选择性地减少了干细胞向神经元的分化率，在海马区也得到了相似的结果。结果显示，cGMP调节脑内神经干细胞的分化，高浓度的cGMP可促进其向神经元的分化，而低浓度的cGMP则促进非神经元类细胞的分化。

2.3.2 对神经前体细胞诱导分化的作用

NO可调节小鼠脑内神经前体细胞（Neural progenitor cells，NPCs）的增殖和分化。 Cheng等[22]以 L-NAME或 NO 清除剂hemoglobin处理培养的小鼠皮质神经前体细胞，可提高细胞的增殖能力，降低其分化为神经元的能力；而NO供体硝普钠则抑制NPC的增殖并增强其向神经元的分化。BDNF也能减少NPC的增殖，增加分化神经元nNOS的表达，其促神经元分化效应可被L-NAME和hemoglobin所阻断。在鼠室下区NO也有着类似的调节作用，NOS抑制剂可提高NPC的增殖能力并抑制神经元的分化。这些发现说明NO作为旁分泌信使，被新产生神经元内的神经营养因子信号所刺激，从而调控NPC的增殖和分化。

大量研究表明，NO-cGMP信号途径在干细胞诱导分化中发挥着重要作用，通过该信号途径的活化，可以诱导胚胎干细胞及不同来源的间充质干细胞向心肌细胞、内皮细胞、神经细胞、成骨细胞等方向分化，促进神经干/前体细胞向神经元的分化。将NO-cGMP信号途径相关分子与其他干细胞诱导因子相结合，能提高不同来源干细胞的定向分化能力，将为干细胞在心血管疾病、神经退行性疾病、周围神经损伤修复等方面的临床治疗提供新的方向。

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NO-cGMP Signaling in Stem Cell Differentiation

WEI Leixin,WANG Qing,LIU Fang.Department of Anatomy,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.

LIU Fang(E-mail：liu_fang403@163.com).

Nitric oxide－cyclic guanosine monophosphate;Signaling;Stem cell;Induction;Differentiation

Q813.1+1

B

1673－0364（2012）04－0232－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.04.015

第二军医大学大学生创新基金（ms2011041）。

200433 上海市 上海第二军医大学解剖学教研室。

刘芳（E-mail：liu_fang403@163.com）。

【Summary】The nitric oxide-cyclic GMP (NO-cGMP)signaling system mediates important physiological functions associated with various integrative body systems.Massive researches show that NO–cGMP signaling plays an important role in inducing the stem cells into the myocardial cell,neuron,etc.Besides,NO–cGMP signaling can also promote the axonal elongation.This review focuses on the role of NO-cGMP signaling in the differentiation of stem cells such as embryonic stem cells(ESCs),mesenchymal stem cells(MSCs)and neural stem cells(NSCs).

2012年6月17日；

2012年7月20日）