α－地中海贫血的筛查进展

唐海深 综述 李东至 校审

（广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心 产前诊断中心，广东 广州 510623）

地中海贫血（thalassemia，地贫）又称珠蛋白生成障碍性贫血，是由于珠蛋白合成不足所引起的遗传性溶血性贫血，是人类最常见的单基因遗传病，保守估计全世界有近2亿地贫基因携带者，此病具有临床上的严重性及世界范围内的高发病率，严重危害人类健康。根据缺如或合成减少的珠蛋白链的种类，地中海贫血分为α、β、γ、δ等几种亚类，其中α－地中海贫血最常见，β－地中海贫血次之。α－地贫主要见于东南亚和地中海地区，在我国则主要集中在南方地区，以广西、广东、海南和香港最多见，携带率为5．4%～17．55%不等，其中广东省的α－地贫基因携带率为8．53%［1］。α－地贫临床表现与α－珠蛋白链的合成减少的程度相关，静止型和轻型α－地贫携带者自身可无临床症状，但按照孟德尔遗传规律，可能孕育重型地贫的胎儿，因此在α－地贫高发区进行筛查尤为必要。随着人们的不断总结，新技术的不断涌现及联合应用，α－地贫的筛查向敏感度和特异度更高的方向发展，本文就α－地中海贫的血分子病理学基础、遗传学特点及其筛查方法做一综述。

1 α－地中海贫血的分子病理学基础

α－珠蛋白基因位于16号染色体上（16p13），每条染色体上有2个连锁的α－珠蛋白基因（α1和α2），共4个，正常人以αα／αα表示。α－地中海贫血（α－thalassemia，α－地贫）是由于α－珠蛋白基因缺失或突变，使α－珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制而引起的遗传性溶血性贫血，是人类最常见且危害最大的单因遗传病之一。α－地贫根据单倍型染色体是否能合成α－珠蛋白链分为α－地贫－2（α＋－地贫）和α－地贫－1（α0－地贫），根据限制性内切酶图谱法是否能检出明显的基因缺失分缺失型α－地贫和非缺失型α－地贫。我国最常见的缺失型α－地贫－1为－SEA，缺失型α－地贫－2为－α3．7和－α4．2，非缺失型α－地贫以Hb CS与Hb QS最为多见。

2 α－地中海贫血的遗传学特点

α－地贫在临床上分为4种类型：静止型、标准型、Hb H病和 Hb Bart’s胎儿水肿综合征，其分子机制分别为有1、2、3、4个α－基因缺陷（缺失或突变）。静止型和标准型者可无临床症状或仅轻微的血液学改变；Hb H病有轻至中度贫血，肝脾肿大，黄疸等；Hb Bart’s水肿胎常于妊娠晚期（23～38周）死亡或早产后数小时死亡。另外，一些非缺失型Hb H病和非缺失型α－地贫纯合子患儿贫血严重，甚至需要输血治疗。若夫妇双方均为－SEA基因携带者，则胎儿有四分之一机会Hb Bart’s水肿胎；若夫妇一方为－SEA基因携带者，另一方为非缺失型α－地贫携带者，则有四分之一机会出生非缺失型Hb H病患儿。因此在α－地贫高危地区筛查－SEA基因和非缺失型α－地贫基因携带者尤为必要，是识别高危人群、预防重型地贫患儿出生的重要手段。

3 筛查方法

地贫的检验方法很多，目前，国内外用聚合酶链反应（PCR）检测α－地贫基因的方法进行地贫的诊断是目前诊断地贫的金标准。但由于其方法复杂、设备技术要求高及费用昂贵等原因，不能作为常规、大规模的检查手段。大多数地贫基因携带者都不会知道自己带有这种遗传基因，因此只有通过对新生儿、婚前检查、婚检及产检人群进行地贫筛查，才能防止重型地贫儿的出生。

3．1 血液学常规检测 地中海贫血的重要特征之一是小细胞低色素性贫血，通过涂片、瑞氏染色可观察红细胞形态，由于贫血轻重不一，红细胞大小不均，可出现异型、嗜碱性点彩红细胞、靶形红细胞、网织红细胞比率增高，贫血越重，异形性越明显。地中海贫血最重要的血液学指标为红细胞平均体积（MCV），红细胞平均血红蛋白量（MCH），血红蛋白（Hb），此外还有红细胞计数及红细胞压积。正常成人的 MCV、MCH的正常值分别为为82～95fl、27～31pg。一般来说以 MCV≤82 fl，MCH≤27．0 pg作为地中海贫血的可疑指标。有研究显示：以MCV≤80 fl为界，筛查α－地贫－1（主要为－SEA／αα）的敏感性为92．9%，特异性为83．9%［2］。以MCH＜26．5 pg为界，筛查α－地贫－1的敏感性为95．2%，特异 性为 82．3%［3］。邹汉良等［4］的研究显：以红细胞计数／平均红细胞体积比值5．9作为筛查指标其灵敏度为95．1% ，特异度为92．0%。值得注意的是，在机体缺乏铁、锌、铜、维生素B6以及铅中毒等情况下，也可出现外周血红细胞MCV和MCH降低，应注意鉴别，临床常有对这类患者以铁剂治疗，但往往达不到预期的疗效。

3．2 红细胞渗透脆性试验 其原理是地中海贫血携带者的红细胞膜表面粗糙、凹陷、折叠和浆膜扩展，膜与内容物之比增大，对渗透溶解的抗性增加，在0．32% （或0．36% ）NaCl中溶解度降低 （脆性降低），一管法是地中海贫血群体筛查的一种简便方法。Supatra S等［5］的研究显示，利用红细胞脆性试验筛查α－地贫－1的敏感性和特异性分别为95．0%和86%。红细胞渗透脆性试验是地中海贫血群体筛查的一种简便方法，Hb Bart’s胎儿水肿综合征和Hb H病患者明显降低，标准型α－地贫也可降低，但是静止型α－地贫一般正常。

3．3 血红蛋白分析 血红蛋白（Hb）是人体最主要的蛋白质，承担红细胞运输O2和CO2的功能。人在不同发育时期血红蛋白组成不同，胚胎期主要血红蛋白为：Hb Gower 1（§2є2）、Hb Gower 2（α2є2）、Hb Portland（§2γ2）；胎儿期及新生儿期主要为Hb F（α2γ2），还有少量 Hb A（α2β2）和微量 Hb A2（α2δ2）；成 人 期 血 红 蛋 白 组 成 为：Hb A（α2β2）：96．5%～97．5%，Hb A2（α2δ2）：2．5%～3．5%，HbF（α2γ2）：0～1．0%。α－地贫是由于α－基因缺陷使α－链合成减少，因此新生儿α－地贫会由于α－链减少而导致γ链相对增多，形成 Hb Bart’s（γ4）。由于各种血红蛋白均带电荷，且等电点在7以下，因此在碱性缓冲液中均带负电荷，由于不同的血红蛋白等电点不同，故在电场的作用下因向阳极运动的速度不一而分离。被称为“电泳之父 ”的瑞典学者Tiselius在1937年创建了电泳技术，随后Hb电泳技术因支持物的不同经历了滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、高效液相色谱法及毛细管电泳等。利用Hb A2筛查α－地贫的敏感性和特异性均不高，且与基因诊断的结果可能不符［6］。有文献报道，HPLC检测β地贫与经基因确诊的符合率可达97．6%，而α地贫的符合率为 62．6%［7］。因此血红蛋白分析单独检测成人α－地贫的特异性和敏感性均不高，血红蛋白电泳技术检测α－地贫适用于新生儿期，成人则应联合应用其它筛查方法。1958年Ager等已发现脐血中存在Hb Bart’s，此后此成分与α－珠蛋白基因缺陷间有何关系引起了国内外许多学者的关注。分离定量Hb Bart’s的技术有醋酸纤维膜电泳、等电聚焦（IEF）、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳（CE）等。其中毛细管电泳分辨率高、定量准确、所需样品少，具有快速、高效、敏感、自动化优点，可检测异常血红蛋白、分离定量血红蛋白各组分［8］。与HPLC相比，全自动毛细管电泳技术分离、定量Hb H和Hb Bart’s更加简单、准确［9］。

随着毛细管电泳技术的应用越来越广泛，分离定量Hb Bart’s迈向了准确、高效、自动化的方向。Munkongdee T等［8］对587例泰国新生儿脐血进行毛细管电泳电泳Hb Bart’s定量筛查α－地贫，研究显示：缺失1、2、3个α－基因的α－地贫携带者，其脐血Hb Bart’s含量分别为（0．5±0．2）%、（4．6±0．5）%、20．1；该研究还显示，正常人与α＋－地贫携带者之间的Hb Bart’s含量相互重叠，不能区分。以 Hb Bart’s含量0．2%为界，区分正常人与α＋－地贫携带者的效率最高。何晓玲等［10］，亦用毛细管电泳电泳技术定量Hb Bart’s的方法筛查中山市新生儿的α－地贫，研究结果中Hb Bart’s的含量与基因缺陷个数的关系与 Munkongdee T的研究相符，但Hb Bart’s水平不宜作为诊断静止型α－地贫的筛查指标。可见，全自动毛细管电泳技术分辨率高、定量准确、所需样品少，具有快速、高效、敏感、自动化优点；但是，血红蛋白电泳技术检测α－地贫适用于新生儿期，检测成人α－地贫的特异性和敏感性均不高。

3．4 联合筛查 许多研究表明，联合检测可以大大提高地贫筛查的特异度，但比单项检测的灵敏度降低。MCV（＜80 f L）、红细胞脆性试验（溶血百分率小于60%）、Hb电泳分析（Hb A2＜2．5%）等3种方法单项检测对α－地贫诊断的灵敏度分别为91．0%、81．9%和69．8%，MCV、红细胞脆性和Hb电泳3项联合检测的特异度达100．0%［11］。此外，联合检测与单项检测相比，对轻型地贫具有较好的筛查作用。

4 常见非缺失型α－地贫的筛查

由于Hb Bart’s水肿胎的致死性，临床上出生后最严重的α－地中海贫血类型是Hb H病。Hb H病有两种常见类型：缺失型Hb H病和非缺失型Hb H病，缺失型Hb H病较多见，但非缺失型Hb H病，尤其是那些产生极不稳定的α－珠蛋白变异体的非缺失型Hb H病临床表现更为严重：患者贫血症状更严重、易出现肝脾肿大、需要输血的次数增加［12］。在α0－地贫携带率高的地区（α0－地贫（－SEA）携带率在亚洲不同地区为3%～14%不等，其中泰国北部为4．6%、香港4．1%、广东省4．1%［1］，当夫妻一方为－／αα时，就应排除另一方为非缺失型α＋－地贫携带者。此外，还有非缺失型纯合子（αCSα纯合子与αQSα纯合子）引起水肿胎的报道［13］。目前，已报道近70种非缺失型α－地贫，非缺失型基因改变从mRNA转录、剪接到蛋白质的翻译和修饰不同阶段影响珠蛋白连的延伸或剪接，从而影响珠蛋白基因的表达。因此，非缺失型α＋－地贫携带者的筛查对指导优生和预防重型Hb H病患儿及重型非缺失型纯合子患儿的出生具有重要临床意义。我国常见的非缺失型α－地贫为Hb CS与Hb QS。

4．1 Hb CS筛查 Hb Constant Spring（CS）是我国最常见的非缺失型α－地贫基因类型，广东省的发病率为0．3%［14］。Hb CS的产生是由于α2基因第三外显子CD142（TAA＞CAA）［Term→Gln］的终止密码子突变，使合成的α－珠蛋白链异常延长，具有172个氨基酸残基，其m RNA极不稳定，导致α2－珠蛋白链合成减少。αCS－珠蛋白与α血红蛋白稳定蛋白（αhemoglobin－stabilizing protein，AHSP）受损结合形成Hb CS，在αCSα杂合子中Hb CS约占整个血红蛋白的1%～2%。目前研究显示可通过毛细管血红蛋白电泳技术和高效液相色谱法筛查Hb CS，但毛细管电泳技术更为优越。Can Liao等［14，15］的研究显示：毛细管电泳对Hb CS定量可低至0．1%；99%的αCSα杂合子 Hb CS含量为0．1%～1．0%，均值为0．6±0．1%，而 Hb H－CS的 Hb CS水平高达2．2%；并且毛细管电泳技术筛查Hb CS的敏感性为100%，而高效液相色谱法筛查Hb CS的敏感性只有76%。S．Pornprasert等［24］的研究也证实毛细管泳技术是筛查Hb CS一种非常可靠的手段，Hb CS%的水平在αCSα纯合子与Hb HCS间没有明显区别（2．8±1．3），但均明显高于αCSα杂合子（0．4±0．2）。还有为比较毛细管泳技术和高效液相色谱法筛查Hb CS的研究显示，用两种不同的方法测量比较，毛细管泳技术测得Hb CS的水平更高：αCSα杂合子的 Hb CS（%）分别为0．4±0．2（0．1～0．8）和 0．1±0．3（0．0～1．2），Hb H－CS的Hb CS（%）分别为1．7±1．7（0．2～4．6）和0．6±1．0（0．0～3．7），αCSα纯合子的 Hb CS（%）分别为3．0±1．0（2．0～5．0）和1．0±0．7（0．0～2．7）［16］。

4．2 Hb QS及其他非缺失型α－地贫的筛查 Hb Quong Sze（QS）是由于α2基因第三外显子CD125（CTG＞CCG）［Leu→Pro］的点突变，其发病率在我国非缺失型α－地贫中，仅次于Hb CS。与Hb CS相比，Hb QS极不稳定，高效液相色谱法和毛细管血红蛋白电泳技术均不能筛查Hb QS。近年来兴起的一种遗传学分析方法——高分辨率熔解曲线（high－resolution melting，HRM）技术，能有效地筛查非缺失型α－地贫，引起了越来越多的学者关注。由于核酸分子的物理性质不同，不同核酸分子的片段长短、GC含量及分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置，HRM技术的基本原理就是借助饱和荧光染料监测核酸分子的熔解情况，根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分，可对扩增片段未知突变进行扫描，也能对已知、特定突变位点进行基因分型。

Shih HC等［17］应用 HRM 结合nested PCR，先分别扩增α2－和α1－珠蛋白基因，再分别设计引物扩增3个外显子用于HRM分析，成功检测异常血红蛋白，包括Hb QS和Hb CS，此方法过程较为复杂。Liu YN等［18］单独针对HRM技术快速有效的筛查Hb QS做了一项研究，结果为HRM技术成功将αQSα基因携带者全部检出，曲线集成3簇：正常对照（αα／αα）集成一簇，Hb QS杂合子（αQSα／αα）集成一簇，Hb H－QS（αQSα／－SEA）和 Hb QS－α4．2（αQSα／－α4．2）集成一簇，HRM 检测 Hb QS的敏感性和特异性均为100%。此方法简便、快速，且避免了只扩增α2－珠蛋白基因而导致Hb H－QS和Hb QS纯合突变可能会因为熔解温度与野生型相差不大而难以区分的假阴性。随后，Liu YN等［19］又在 HRM 技术筛查Hb QS的基础上增宽了范围，用HRM技术分别筛查α－珠蛋白基因的3个外显子，结果为HRM技术成功将非缺失型α－地贫携带者与异常血红蛋白全部检出，敏感性和特异性亦均为100%。HRM技术具有操作简便、快速、高通量、低成本、闭管操作等优点，但是，HRM技术对PCR反应、熔解仪器、荧光染料要求较高，突变扫描也不能精确区分扩增片段中不同杂合突变所致的曲线差异。

5 意 义

α－地贫筛查是确诊与控制α－地贫的基石，通过筛查可以有效地控制重型地贫儿的出生，同时节省医疗资源。此外，临床上的基因诊断一般是联合应用gap－PCR技术和反向点杂交技术分别检测3种常见的缺失型α－地贫基因型（－SEA、－α3．7、－α4．2）和3种常见非缺失α－地贫基因型（αCSα、αQSα、αWSα），这两种方法只能能检测出98%左右的α－地贫，还可能漏诊罕见的α－珠蛋白基因簇的大片段缺失或罕见的点突变，而携带大片段缺失（α0－地贫）的患者一般会有临床表现，且筛查为阳性。因此在日常临床工作中，α－地贫的诊断应按照血液学常规检测—血红蛋白电泳分析—基因分型的顺序，不能跳过筛查直接基因诊断，以免漏诊。

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