RNAi沉默PRDXⅢ基因表达诱导U251胶质瘤细胞凋亡的实验研究

左书浩 焦庆芳 焦保华

本文通过RNAi技术沉默人U251胶质母细胞瘤细胞系中PRDXⅢ的表达，探讨其对胶质瘤细胞凋亡和生长的影响，为胶质瘤治疗提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 材料 人脑胶质瘤U251细胞株购自ATCC公司，RPMI-1640培养基购自GIBCOBRL公司，RT-PCR二步法试剂盒购自MBI公司，LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司，Opti-MEM I Reduced Serum Medium购自Invitrogen公司，凋亡检测试剂盒购自晶美公司，DNA Ladder试剂盒购自碧云天生物技术研究所。PRDXⅢ引物1对，内参照GAPDH引物1对，均由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列为:PRDXⅢ:上游引物:5’-CTTAAGAAGATGGCGGCTGCTGCTGTAGGAC-3’下游引物:5’-CTCGAGCATGGGTGATCTACTGATTTACCTT-3’GAPDH:上游引物:5’-ACCACATGCCCAGAGGGTCC-3’下游引物:5’-AGGAGGCTGGGCTGTCTGTA-3’基因特异干扰序列表达载体pGenesil-1-PRDXⅢ-1、pGenesil-1-PRDXⅢ-2、pGenesil-1-PRDXⅢ-3由中国武汉晶赛生物有限公司进行设计与合成。

1.2 方法

1.2.1 U251细胞培养、传代与保种:U251细胞用RPMI-1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱培养，每2～3天换液1次，培养细胞生长至80%融合。加入新鲜的0.25%胰酶消化细胞，离心沉淀，然后分置细胞于新的培养瓶中，传代比例为1∶3。最后按照每个冻存管2×106个细胞保种。细胞梯度冷冻，最后置于液氮罐中保存。

1.2.2 细胞转染:以0.25%胰酶消化收集细胞，转种于6孔板，每孔1×105个细胞，加入2 ml含小牛血清和抗生素的培养基继续孵育。当细胞达到80%的融合时移去6孔板内完全培养基，加入1 ml无血清无抗生素培养基，加入转染复合物(含质粒及脂质体)，混匀，培养4～6 h后，换有血清有抗生素的完全培养基2 ml。转染24 h后，荧光显微镜下观察6孔板内荧光以检测基因转染效率。以未转染的空白对照组，空载体转染组，无关序列转染组为对照组。

1.2.3 PRDXⅢ的分离、扩增:按照Trizol试剂说明书步骤一步法提取总 RNA。合成 cDNA，通过 RT-PCR法扩增 PRDXⅢ(95℃预变性 3 min，95℃变性 30 s，61.4℃退火 35 s，72℃延伸1 min，共33个循环，最后72℃延伸10 min)和内参基因GAPDH(95℃预变性 5 min 后，95℃变性45 s，56℃退火40 s，72℃延伸40 s，共35个循环后，72℃延伸10 min终止反应)，筛选有效的基因特异干扰序列。

1.2.4 Western blot检测胶质瘤细胞中PRDXⅢ蛋白的表达:转染后48 h，以含0.25%胰蛋白酶消化收集细胞(细胞经预冷的PBS漂洗3次);加入450 μl RIPA裂解液裂解细胞(冰上操作)，在振荡器上混匀4～15 min，14 000 g离心15 min(4℃)，弃沉淀;处理后的样品加入样品缓冲液，煮沸5 min，12 000 g离心5 min，取上清液，用分光光度计对蛋白质进行定量检测。将蛋白样本进行凝胶电泳，然后电转移至PVDF膜。TBS洗膜3次后装入密封袋，加入1∶4 000稀释的一抗，4°C过夜，缓慢摇动。弃一抗，TBS/T缓冲液室温润洗，5 min×4次。装入新的密封袋，加入1∶5 000稀释的的二抗，室温孵育1 h，缓慢摇动。弃二抗，TBS/T缓冲液室温润洗，10 min×3次，浸泡于TBS中待检测。加入DAB显色液，显色5 min。以β-actin为内参，其一抗稀释度为1∶3 000。在凝胶成像系统上分析处理蛋白条带，拍照。以PRDXⅢ蛋白条带OD值与内参照OD值的比值来表示蛋白表达的量。

1.2.5 DNA Ladder:每 106个细胞中加入 500 μl添加了蛋白酶K的样品裂解液，Vortex混匀，充分裂解细胞，50℃水浴消化过夜。加入500 μl Tris平衡苯酚，剧烈震荡10～30 s，以使酚相和水相充分相互作用以抽提样品。吸出约300 μl上清液，加入60 μl 10 mol/L醋酸铵和600 μl无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉淀产生，－20℃冻存1 h，以充分沉淀小片断DNA。12 000 g离心10 min，弃上清，加入70%乙醇洗涤 DNA沉淀1次。尽量吸除残余的乙醇，加入50～100 μl TE溶解DNA，取部分抽提得到的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.6 PI染色:转染后48 h PI染色观察细胞凋亡。将盖玻片取出，滴上1滴PI液，荧光显微镜下观察红色荧光。实验分组同上:干扰质粒实验组，无关序列对照组，空白载体对照组及未处理的空白对照组。

1.2.7 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡:转染后48 h收集细胞约5 ×106个，离心，1 000 r/min，5 min，弃去培养液;PBS洗涤2次;离心，1 000 r/min，5 min，去上清液;加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1 ～2 h;离心，1 000 r/min，5 min，弃去固定液;PBS重悬细胞，400目的筛网过滤1次，1 000 r/min，离心5 min，弃去PBS;用1 ml PI染液染色，4℃避光30 min;流式细胞仪检测。

1.2.8 MTT比色分析转染后细胞增殖活性:将U251细胞接种到96孔板，每孔2×103细胞，待细胞达80%融合后，选择基因特异干扰序列3由脂质体包裹进行转染。转染后48 h，每孔加入10 ～15 μl MTT(5mg/ml)，5%CO2培养箱中孵育4 h，将孔内液体全部吸去，每孔加入100 μl DMSO，10 min后用酶标仪在490 nm波长处读取吸收值。计算干扰后对细胞的生存抑制率。以空白组、空载体转染组和无关序列转染组作对照。

1.3 统计学分析应用SPSS 11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR分析转染后PRDXⅢmRNA水平变化 半定量RT-PCR检测示，空载体组和无关序列组PRDXⅢmRNA表达无明显变化，干扰序列1、3使PRDXⅢmRNA的表达明显降低，尤以干扰序列3的效果最显著，对PRDXⅢmRNA的表达抑制率为76%。见表1、图1。

表1 干扰后4组PRDXⅢmRNA表达水平的变化±s

表1 干扰后4组PRDXⅢmRNA表达水平的变化±s

注:与空白对照比较，*P ＜0.05

类别 PRDXⅢ/GAPDH 抑制率(%) P值0.84 ±0.025 0.00干扰序列1 0.26 ±0.024* 69干扰序列2 0.68 ±0.020 19干扰序列3 0.20 ±0.047*空白对照76

2.2 Western Blotting分析转染后PRDXⅢ蛋白表达变化Western Blotting结果显示，空载体组和无关序列组PRDXⅢ蛋白表达无明显变化，干扰序列1、3对PRDXⅢ蛋白表达有明显抑制作用，以干扰序列3作用最显著，抑制率达到63.9%。见表 2、图 2。

图1 PRDXⅢ基因有效特异干扰序列筛选分析

表2 干扰后各组PRDXⅢ蛋白表达水平±s

表2 干扰后各组PRDXⅢ蛋白表达水平±s

注:与空白对照比较，*P ＜0.05

类别 PRDXⅢ/β-actin 抑制率(%) P值0.72 ±0.015 0.00干扰序列1 0.33 ±0.020* 54.2干扰序列2 0.56 ±0.026 22.2干扰序列3 0.26 ±0.020*空白对照63.9

图2 Western Blotting检测干扰后PRDXⅢ蛋白表达

2.3 DNA ladder 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成180-200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。试验结果显示干扰组出现明显梯形电泳条带，说明有较明显的细胞凋亡，而空白对照组，空载体和无关序列组未见梯形电泳条带。见图3。

图3 DNA ladder显示干扰组DNA梯形电泳条带

2.4 PI染色 空白对照组，空脂质体组和空载体组细胞未见明显凋亡;而干扰组细胞染色质出现浓缩状态，细胞核的染色质高度凝聚，部分细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体，符合凋亡的形态学改变。见图4。

2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 流式细胞仪检测显示空白对照组、空载体组、无关序列组和干扰组细胞凋亡率分别为(2.3±0.6)%、(2.7 ±0.7)%、(3.5 ±0.6)%和(35.9 ±4.8)%，干扰组细胞调亡率明显高于空白对照组、空载体组、无关序列组(F=219.76，P ＜0.01)，而空白对照、空载体组和无关序列组之间促凋亡率的差异无统计学意义(P＜0.05)。见图5。

图4 PI染色

图5 FCM检测干扰后48 hU251细胞凋亡率

2.6 MTT检测RNAi后U251细胞生长活性 MTT比色实验结果显示空白对照组、空载体组、无关序列组和干扰组转染后48小时的光吸收值分别为(1.26 ±0.06)、(1.22 ±0.09)、(1.19 ±0.02)和(0.70 ±0.07)，干扰组光吸收值明显低于空白对照组、空载体组和无关序列组，而空白对照组、空载体组和无关序列组相互间差异无统计学意义(P＞0.05)。干扰组对U251细胞生长的抑制率为44.4%，明显减慢了细胞生长(F=49.9，P ＜0.01)。

3 讨论

RNA 干扰(RNA interference，RNAi)［1］是双链 RNA(double－stranded RNA，dsRNA)介导的特异性基因表达沉默现象，是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的dsRNAs时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。由于这种现象发生在转录后水平，故又称为转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。

RNAi包含至少下列几个连续的步骤［2］:(1)外源性或内源性的dsRNA在细胞内与一种RNA酶Ⅲ(RNAⅢendonucleasedicer)结合，随即被切割成含有3’端单链尾巴及磷酸化的5’端的21-23nt的短链 dsRNA，是 RNAi的起始诱导物，即 siRNA［3］。(2)siRNA与相关蛋白形成RNA引导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)［4］，RISC 具有核酸酶活性，它可以在siRNA的引导下特异降解相应的mRNA。(3)siRNA按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RICS复合体结合mRNA。(4)siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21-23nt的片断，特异性地抑制靶基因地表达。而新形成的dsRNA可再次形成RISC复合体，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。因此，每个细胞仅需要几个siRNA就能引起强烈的RNAi反应。siRNA还可以在RNA依赖性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)的作用下大量扩增，并转运出细胞，使RNA扩散到整个机体并可以传代［5］。最近的研究也有显示，RNAi不仅在转录后水平发挥作用，而且在转录水平和翻译水平也有一定程度的抑制特异基因表达的作用。针对靶基因设计出特异性的具有高效抑制作用的siRNA序列是RNAi成功的关键。在siRNA序列的选择上应注意:(1)siRNA序列的长度。序列太短则不足以诱导特异性的基因抑制，太长又会激活哺乳动物细胞的抗病毒防御机制。21nt的siRNA既可在哺乳动物细胞介导基因特异性的抑制作用，又不会引起宿主细胞非特异性的抗病毒反应，所以目前多数的siRNA是21nt的双链。另外，在3’对称悬挂2nt的碱基(通常为UU)的siRNA降解靶基因mRNA最为有效［6］，尤其是在反义链3’悬挂2ntUU对诱导哺乳动物细胞中有效的RNAi尤为重要［7］。(2)靶序列的选择。在目标分子的作用部位选择上，一般认为在cDNA的转录起始位置下游50～100 bp处较好，要避开转录的非翻译区。在靶基因的成熟 mRNA序列AUG起始密码子后寻找到以“AA”开头的序列，再向下游取19nt作为正义序列。(3)干扰分子的GC含量一般在30% ～70%，最好50%左右。我们按照上述原则设计了3条siRNA序列，利用真核表达载体转染U251细胞。转染后24和48 h分别以RT-PCR和Westtern blotting检测PRDXⅢmRNA和蛋白的表达，发现第1、3条siRNA序列较好地抑制了PRDXⅢmRNA和蛋白的表达，尤以第3条最佳，对PRDXⅢmRNA和蛋白表达的抑制率分别达到76%和63.9%。在后续的实验中我们利用第3条干扰序列进行进一步的凋亡研究。PRDXⅢ与细胞凋亡有关，PRDXⅢ过表达可以抑制药物诱导的凋亡，而降低PRDXⅢ表达使得细胞对凋亡更加敏感［8，9］。我们利用RNAi技术成功地抑制了U251细胞中PRDXⅢ基因和蛋白的表达，转染后48 h流式细胞仪检测，干扰组细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义;DNA ladder显示干扰组有凋亡典型的梯形条带，而各对照组未见此现象;PI染色显示干扰组细胞染色质出现浓缩状态，细胞核的染色质高度浓染，部分细胞核裂解为碎块，符合凋亡的形态学改变;MTT显示干扰组对U251细胞生长的抑制率为44.4%，明显减慢了细胞生长，而无关序列组、空载体组和空白对照组之间细胞生长无明显差异。这些结果表明，PRDXⅢ基因在胶质瘤中高表达可以抑制肿瘤细胞凋亡，从而使其增殖加快，而抑制PRDXⅢ基因表达能够诱导胶质瘤凋亡，减缓肿瘤生长，因此，PRDXⅢ基因有可能成为胶质瘤基因治疗的靶基因，为胶质瘤治疗提供了一个新的选择。

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