灭蚊真菌贵阳腐霉总RNA提取方法的建立

段斯亮 于 声 苏晓庆

(柳州医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室，①检验教研室 广西柳州 545006;②贵阳医学院生物学教研室)

灭蚊真菌贵阳腐霉总RNA提取方法的建立

段斯亮 于 声①苏晓庆②

(柳州医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室，①检验教研室 广西柳州 545006;②贵阳医学院生物学教研室)

①目的 提取贵阳腐霉(Pythium guiyangense)的总RNA。②方法 诱导后的菌丝加入硅藻土，用液氮研磨成粉末状，在变性剂存在的条件下，用酚/氯仿/异戊醇抽提，除去DNA和蛋白质，再用醋酸钠和70%乙醇沉淀RNA，去除多糖。③结果 用该方法提取的RNA样品，经紫外分光光度计检测，OD260/OD280=1.98，OD260/OD230=2.30;1%琼脂糖凝胶电泳检测，28SrRNA带的亮度约为18SrRNA带的2倍。④结论 成功地提取了贵阳腐霉总RNA，且RNA的纯度和完整性很好，能够达到进行分子生物学领域其他操作研究的标准。

贵阳腐霉 硅藻土 RNA提取

在基因表达调控研究中，RT－PCR(逆转录多聚合酶链反应)、Northern分析、cDNA文库(含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克降群)的构建等都需要高质量的RNA，获得完整性良好的RNA已成为分子生物学各研究领域首先要解决的问题。在所有的RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。RNA酶很稳定，一般而言反应不需要辅助因子，而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起严重的后果。目前，许多RNA提取方法已建立起来，这些方法均用到RNAase(核糖核酸酶)的抑制剂如肌盐、酚、氯仿、氯化艳密度梯度离心等［1～3］，但是，仍有不少实验材料由于富含RNA酶、多糖、多酚等物质或者降解RNA及与RNA形成难溶物等方式严重干扰RNA的提取［4，5］，常常导致实验的失败。我们在用RT－PCR克隆贵阳腐霉的类枯草菌素蛋白酶基因时，发现用一步法提取RNA，结果并不理想，污染和降解现象较多。为了解决上述问题，我们在参考多种RNA提取技术的基础上，发现了一种简单、有效的适合腐霉菌的RNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种。贵阳腐霉(P.guiyangense)，由本实验室保存。

1.1.2 培养基。SFE 培养基［6］，诱导培养基［7］。

1.1.3 主要试剂。RNA提取液为:异硫氢酸胍6 mol/L，Tris－ HCl(pH 7.5)0.2 mol/L ，NaCl 0.5mol/L，EDTA 0.01 mol/L，SDS 1%，0.15mol/L β － 巯基乙醇;硅藻土;酚/氯仿/异戊醇(v/v 25:24:1);NaAc(3mol/L，pH5.5);70%乙醇(DEPC 水配制);异丙醇。

1.2 方法 切取1cm×1cm SFE培养基活化5天的菌块，转入100mL诱导培养基，26℃，110rpm振荡培养。培养至所需时间，收集菌丝，用DEPC－H2O过滤冲洗干净并滤干(尽量干燥)。置于研钵中加入硅藻土，倒入液氮研磨至粉末状，趁液氮尚未挥发光，把粉末(约0.8g)转移到RNase－free的1.5mL离心管中，加入1.0mLRNA提取液，剧烈振荡混匀，冰浴15min。加入200μL酚/氯仿/异戊醇(v/v 25:24:1)混匀，冰浴 15min。4℃，12000r/min离心20min。取上清移入另一RNase－free的1.5mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(v/v 25:24:1)再抽提一次;转移上清，加入等体积冰冻异丙醇，－20℃放置60min。4℃，12000r/min离心20min。弃上清液，将RNA沉淀用DEPC－Water溶解，加入 1.5mL 3mol/L NaAc，0℃ 过夜。4℃，10000r/min离心20min。用70%乙醇洗涤沉淀2次，室温晾干，加入30μL DEPC－Water溶解沉淀。立即使用或－70℃保存。

1.3 RNA质量的检验

1.3.1 RNA的纯度。用BECKMAN紫外分光光度计测量样品在 230nm、260nm、280nm 处的 OD值，计算 OD260/OD230、OD260/OD280的结果。

1.3.2 RNA的完整性。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，28SRNA与18SRNA的亮度比约为2。

2 结果

2.1 RNA的纯度 吸取1μLRNA，用99μL超纯水稀释100倍，在BECKMAN紫外分光光度计中检测，OD260/OD280=1.98，OD260/OD230=2.30，说明RNA纯度很高，无蛋白质、酚类污染。

2.2 RNA的完整性 取1μgRNA样品进行1%琼脂糖凝胶(含1μg/mL溴化乙锭)电泳，130v电泳40min后在凝胶成像系统中观察，结果显示28SrRNA、18SrRNA与5SrRNA带型整齐，无拖尾，而且28S带的亮度约为18S带的2倍，5S带的亮度较低，说明RNA完整性很好，点样孔中及其附近也未发现有DNA的污染。见图1。

图1 贵阳腐霉RNA电泳图

3 讨论

贵阳腐霉是一种丝状真菌，富含RNase、多酚、多糖。多糖具有与RNA相似的理化性质，在提取总RNA时，多糖等易与RNA一起沉淀下来，RNase易使RNA发生降解［8］。所以使用一步法提取RNA，污染和降解现象严重。考虑到以上因素，本方法特别采用了能吸附RNA酶的硅藻土研磨。一般的提取方法都是采用液氮研磨，但由于真菌材料使用了液体培养，即使过滤后菌丝体仍含有较多的水分，液氮冷冻会形成冰晶而妨碍研磨。研磨时间越长，就越增加RNA酶污染的机会。而硅藻土是一种黏土，能吸附RNA酶［9］，有效抑制RNase活性，而且使得研磨过程更加容易和快速。并且实验中把变性剂中异硫氢酸胍的浓度提高1.5倍，在细胞破碎后能强烈抑制RNase活性。一步法使用酚/氯仿/异戊醇抽提一次，DNA污染严重;而本方法用酚/氯仿/异戊醇多次抽提，使RNA留在水相而DNA和蛋白质进入有机相，能将蛋白质清除干净，去除DNA污染。用醋酸钠沉淀RNA粗品，能除去高含量的多糖，结果表明，此步的改动较一步法可除去绝大部分的多糖，且RNA样品完好。

在检测RNA样品的完整性时，考虑到变性琼脂糖凝胶电泳较麻烦，且上样量较多，我们采用了非变性琼脂糖凝胶电泳。从图1中可见，RNA电泳后28S、18SrRNA与EB的结合量比值约为2:1，表明RNA未发生明显降解;点样孔中及其附近也未发现有DNA的污染;28SrRNA后拖尾，可能与上样量较多有关，也与采用非变性琼脂糖凝胶电泳有关。

本实验结果表明，此方法能够获得高纯度完整的RNA，其效果优于传统的一步法，适用于富含RNase和多糖的腐霉菌丝总RNA的提取，为贵阳腐霉功能基因的表达研究奠定了基础，同时也为其它真菌总RNA的提取提供了一定的参考依据。

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R 392

A

2095－2694(2012)01－020－02

广西教育厅科研项目(编号:200810MS026)，柳州医学高等专科学校硕士研究生科研启动项目(编号:2007Y01)。

(2011－08－29 收稿)(王一伊 编辑)