自配染液进行整块组织H.E染色制片的研究

蒙兆年

(宁夏师范学院医学院 宁夏固原 756000)

本实验利用自行配制的染液，通过具体实验进行整块组织H.E染色制片。此法制成的切片染色效果较好，色彩更加均匀。

1 材料与方法

1.1 材料 本实验所用切片石蜡、羊肝脏、载玻片、盖玻片、医用酒精、福尔马林溶液、苏木素液、伊红染液、二甲苯、蒸馏水等。

1.2 主要实验仪器 德国徕卡2016超薄切片机、YB－6型生物组织石蜡包埋机、DK－型电热恒温水槽、泰斯特电热恒温培养箱、45角式系列台式低速离心机、YT－6C型生物组织摊烤片机、YTG－5E型生物组织处理多用机等仪器。

2 方法

2.1 染色液的配制 ①苏木素染色液。配制成分:苏木素染色剂15mg，蒸馏水40mL，钾明矾600mg，碘酸钠5mg，将4种药品混合，每次染色现用现配。②新型伊红配制染液。配制成分:伊红R250mg，95%酒精50mL，蒸馏水50mL，冰醋酸少许。配制过程:现将250mg伊红溶液溶于蒸馏水2mL中，溶解后将冰醋酸一滴一滴加入其中，在滴冰醋酸的过程中边滴边搅动，这时可见沉淀形成，接着再往液体中加入蒸馏水2mL。继续等冰醋酸至沉淀不再增强为止。然后过滤将所沉淀的物质置于50°～60°干燥箱中烤干，烤干后将沉淀物溶于50mL的95%酒精中即成。此法配制的伊红染液也是边用边配，以保持所配液体的新鲜和成分的纯度性。

2.2 操作步骤 ①固定:整块组织进行固定时可用BOUIN液或福尔马林等进行固定，固定的时间一般为36小时左右。因为整块组织进行染色时所取材组织块大，因而固定的时间也要长。这样就可充分保证固定液渗透到组织块中，达到固定的目的，对成分进行保护，更好地保证了制作切片的质量。②浸洗:将固定后的组织块按常规的方法放入蒸馏水中进行浸洗。③染苏木素液:将浸洗后的组织块与染液按1:6的比例进行浸洗染色。染色时间应该考虑取材的组织块的大小和气温高低。一般情况下整块组织染色的时间较长，需要4小时左右。④浸洗分色:可用蒸馏水进行浸洗。在浸洗的过程中每1～2小时可置换一次蒸馏水，直到不再有余色溢出为止。浸洗的时间一般要4小时左右，这时组织块表面呈现紫红色。⑤蓝化:接着将组织块放在容器中用自来水冲洗4小时左右，然后放置2小时，再更换一次自来水，再放置2小时。处理后的组织块呈现蓝色。⑥梯度浓度酒精脱水:将经过上述步骤处理后的石蜡组织块经70%、80%、90%酒精进行脱水。⑦伊红染色:在自制的伊红酒精染液中浸染约2小时左右，材料与染液的比例也按1:6的比例进行染色。⑧盐酸酒精进行分色:将伊红染色后的组织块经过95%酒精进行分色大约1分钟左右。⑨纯酒精进行脱水:将盐酸酒精分色后的组织块经100%纯酒精进行脱水1小时左右。⑩二甲苯透明:将脱水后的石蜡组织经二甲苯进行透明，以便除去组织中的杂质成分。○11石蜡组织包埋:将石蜡放进装有经过上述途径制作的石蜡组织块中，进行包埋。○12切片:将包埋后的石蜡组织块用超薄切片机将通过以上各种途径制作的石蜡组织切片切成5～8μm厚的切片。后续其他制作程序与传统石蜡组织切片制作程序无异。以上就是整块组织H.E染色制作切片法的步骤。

3 实验细节的改变

整块组织H.E染色制片，有别于传统石蜡切片单片片染制作法，从操作步骤上来说，主要从以下几个方面进行了改变。

3.1 染色时间的改变 传统石蜡单片片染制作时苏木精染色的时间是5～10分钟左右;伊红染色的时间是3～5分钟左右;而整块组织H.E染色时间制作者经过多次实验后，认定为在苏木精染液中需4小时为最佳;在伊红染液中需2小时为最佳，因为如果染色时间太短的话，染液就不能很好地渗透到组织材料内部，经过以上时间段的染色后，效果就很好了。

3.2 气温对染色的影响 气温对染色的效果有一定的影响。染色时气温不合适，可能会导致制片所使用的染液出现变性、凝固、沉淀等现象。所以在整块组织H.E染色制作切片的过程中，制作时周围温度太低或太高都不行，一般要使用的最佳温度是25～30℃为最佳，如果周围温度达不到这个要求，制作者就应该将所取材制作的组织材料放置在恒温培养箱内，以便保持染色时的温度恒定，从而达到最佳的染色效果。

3.3 酒精分色时间的调整 传统石蜡组织单片片染制作时用盐酸酒精分色一般在10秒左右。整块组织H.E染色制片在使用盐酸酒精分色时，因为所取材的组织块比较大，分色时间用10秒左右，显然是不行的，这时应将时间相应延长。一般使用95%酒精分色1分钟为最佳，这样做就可以让内部的组织更好地进行分色。

3.4 苏木精染色后蒸馏水浸洗程度的控制 因为浸洗程度达不到要求，细胞核就会呈现一团紫蓝色，细胞质也会染上深蓝色。这样在制片的过程中就会恶性循环，影响伊红的染色。制作者用蒸馏水进行浸洗，每1～2小时换一次蒸馏水，这样一直保持操作下去，到不再有余色溢出为止。苏木精染色后浸洗的时间一般需4小时左右，这时组织块呈现紫蓝色，就会达到所制作的要求。

3.5 实验关键程序的调整 石蜡组织整块H.E染色切片制作法与传统石蜡组织切片片染制作法的关键区别是对取材组织染色时间的调整，整块组织H.E染色制作切片法是将所取材的组织染色时间改变在组织包埋切片之前进行。当组织切片后就不再染色，直至贴片至封固，从而成片。

4 讨论

4.1 组织染色均匀，色彩更加鲜艳 只要制作者在制作的过程中，把握好染色时间，染色时就不会出现外深内浅的染色现象。常用的酸性染料伊红染色所显示出来的红色和碱性染料苏木素染色显示的蓝色从色泽对比上来说更加鲜艳，在显微镜下的观察效果会更好。

图1 整块组织H.E染色制作切片法与传统切片单片片染制作法的结构染色效果对比图(取材:羊肝脏)

由图1不难看出，整块组织H.E染色制作法制作出来的切片比传统石蜡组织切片单片片染制作出来的切片染色效果更好，其组织染色更加均匀，色彩更加鲜艳，与传统制作法相比，并无明显的组织结构差异。制作者在染色时一定要把握好染色的时间，染色时间过长或过短都会导致染色效果不佳。苏木精染色的时间一般是4小时，伊红染色的时间一般是2小时。而且进行整块组织染色过程中常用的将碱性染料苏木素染色显示的蓝色和用酸性染料将伊红显示的红色二者相比色泽更加鲜艳，在显微镜下的观察效果会更好。

4.2 节省制作者的时间及精力 整块组织H.E染色制作时可同时浸染数个不同器官系统的组织块，为制作者节省大量的时间及精力，是制作大量生物医学教学切片的首选方法。制作出来的教学切片成功效率高。无论制作切片时所取材的组织材料是动物亦或是人体的器官组织，由于各自具体组成成分及结构特点的不同，用石蜡组织切片后的H.E染色，如皮肤，就比较难掌握脱水、透明及浸蜡的时间，难以在制作时切成连续的切片，初学者难以掌握。用整块组织H.E染色法制作切片，则大多能获得满意的连续石蜡切片，一批次可制作一百张，比单片片染制作法效率要高，适宜于大批量切片制作需求。

4.3 可对染色进行弥补 整块组织H.E染色制作切片时，染色不理想时，可进行弥补。如染色较浅，可分别进行苏木精及伊红重复染色，如果染色过深，苏木精染色如果过深时，可在95%酒精中进行脱色，以对苏木精进行脱色;伊红染色如果过深时，可在70%酒精中进行脱色，以对伊红进行脱色。染色效果直至制作者满意为止。

综上，本实验利用自行配制的染液进行整块组织H.E染色制作切片，具有许多的优点，适用于大批量教学切片制作需求。本方法切实可行。值得推广应用。

［1］黄亚凤.石蜡切片HE染色体会［J］.内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2004，19(4):436