甲型H1N1流感疫苗注射对小鼠CD4+CD25Foxp3分子表达的影响

丛庆伟，朱 英，吴可亚

(大连医科大学 附属第一医院 感染科，辽宁 大连 116011)

CD4+CD25+调节性T细胞是一群具有免疫负调控功能的T细胞亚群，通过抑制其他免疫效应细胞的激活和增殖，可防止免疫过激或者自身免疫现象的发生。Foxp3特异性地表达于CD4+CD25+Treg细胞表面，CD4+CD25+Treg有赖于Foxp3的存在而发挥功能作用。

有研究发现甲型H1N1流感患者体内该细胞数呈一过性降低，提示甲型H1N1流感病毒参与了机体免疫病理损伤[1-4]。本研究通过观察甲型H1N1流感病毒灭活疫苗对小鼠CD4+CD25+Foxp3分子表达的影响，分析该疫苗对小鼠免疫细胞分子的调控作用，从而揭示该病毒致病的免疫病理机制。

1 材料和方法

1.1 甲型H1N1流感病毒灭活疫苗免疫小鼠

实验动物SPF级BALB/c 小鼠72只，雌雄各半，随机分为高、中、低3个剂量组；以甲型H1N1流感病毒灭活疫苗免疫小鼠，同时设正常对照组，皮下注射生理盐水。每组18只。初次免疫时，高、中、低3个剂量组疫苗注射剂量分别为0.3 mL、0.2 mL和0.1 mL，腹腔/皮下接种小鼠；14 d后进第2次免疫，免疫剂量减半。二次免疫10 d后，再以第1次剂量加强免疫。初次免疫后第4、8、12、19、26、34 天分别处死各组小鼠3只，取脾脏检测。

1.2 FACS分析 CD4+CD25+Treg细胞表型

摘取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，加入Percoll液(Sigma公司)，提纯脾淋巴细胞。用三色直接免疫荧光化学染色进行FACS分析。纯化的脾淋巴细胞用饱和浓度的荧光素标记的大鼠抗小鼠单抗隆抗体进行染色，所用抗体为CD4+FITC、CD25+APC、Foxp3-PE (均购自Biolegend公司)， FITC、PE、APC标记的大鼠抗小鼠IgG作为同型对照(均购自BD公司) 。采用FACS Calibur和 CELLQuest软件(BD公司)进行分析，每次计数10000个细胞，根据细胞大小、分子质量进行筛选，排除死亡的细胞团。设Foxp3细胞门(R1门)、CD4+CD25+细胞(R2门)、CD4+CD25+Foxp3 细胞(R3门)。在 3次分选样本中至少用每种抗体检测3次。

1.3 统计学方法

2 结 果

随着造模时间延长，Foxp3表达平均值第4、8、12、19、26、34天均无明显差别，但0.1 mL实验组平均值比对照组明显减少，0.3 mL组比对照组显著升高，两者差异均有显著性意义(P<0.01)(表1)。CD4+CD25+实验组表达平均值第34天比第4天有所下降，差异有显著性意义(P<0.05)，第8、12、19、26天与第4天相比均无明显差别；0.1 mL实验组平均值与对照组相比显著下降，0.3 mL组与对照组相比显著升高，两者差异均有显著性意义(P<0.01)(表2)。CD4+CD25+Foxp3实验组表达平均值于注射第19、26天比第4天有所升高，差异有显著性意义(P<0.05)，0.1 mL实验组平均值与对照组相比明显升高，差异有显著性意义(P<0.01)，其余时间点间无明显变化(表3)。

3 讨 论

20世纪70年代早期Gershon首次正式提出抑制性T细胞，Sakaguchi等[5]于1995年首次报道CD4+CD25+T细胞，T细胞具有独特的免疫调节作用，以“主动 ”的方式在维持外周免疫耐受中起关键作用。Sakaguchi等发现在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中有一亚群细胞持续高表达CD25+分子(L-2受体a链)，这种CD4+CD25+T细胞如缺乏可引起自身免疫性疾病。CD4+CD25+T细胞在人与小鼠中的分布是不同的，小鼠中占外周 CD4+T细胞 5%～10%，人占30%左右，其中 CD25high占1%～3%，为抑制性T细胞。根据CD4+CD25+Treg来源及作用机制等差异可将其分为天然 CD4+CD25+Treg和获得性CD4+CD25+Treg。天然CD4+CD25+Treg是由胸腺T细胞自然分化发育成熟后进人外周淋巴细胞组织的Treg，在预防病理性自身免疫反应方面起作用。天然CD4+CD25+Treg在胸腺内发育不仅依赖于低浓度、中等亲和力的 MHC2Ⅱ/肽复合物或外周自身抗原在胸腺内皮细胞内提呈，而且也作为CD4+T细胞自然选择的一部分以阴性选择的方式存活下来。随后Sakaguchi和Shevach的研究小组在1998年分别独立建立了该细胞的培养系统，从而使其他学者能在体外研究该细胞的抑制活性[6-9]，直到2001年由Mason和Powry从人的血液中分离到了CD4+CD25+T细胞，并证实其对其他T细胞的增殖作用[10]。

表1 Foxp3表达变化Tab 1 Expression change of Foxp3

1) 与对照组比较，P<0.01

表2 CD4+CD25+表达变化Tab 2 Expression change of CD4+CD25+

1)与第4天比较，P<0.05；2)与对照组比较，P<0.01

表3 CD4+CD25+Foxp3表达变化Tab 3 Expression change of CD4+CD25+Foxp3

1)与第4天比较，P<0.05；2)与对照组比较，P<0.01

Foxp3是foxhead家族成员，2001年由Bennett CL等[11]首次报道，特异性表达于小鼠CD4+CD25+T细胞。Foxp3蛋白在CD4+CD25+T细胞分化发育中发挥关键作用。研究表明通过红或绿色荧光蛋白与Foxp3基因结合，能从单个细胞水平上研究CD4+CD25+T细胞，该方法证实只有CD4+CD25+Foxp3T细胞而非CD4+CD25+TregT细胞具有免疫调节功能，可见 CD4+CD25+Treg功能的维持有赖于Foxp3的存在。Foxp3缺失或突变会造成CD4+CD25+T细胞生成障碍，机体免疫反应变强，产生自身免疫病。

2009年流行的甲型H1N1流感[12-16]，主要导致青壮年人群患病，造成部分患者病情加重而死亡。有研究发现，感染该病毒患者的CD4+T淋巴细胞呈现一过性的减少，提示甲型H1N1病毒的免疫损伤特性。

本研究中，应用甲型H1N1流感病毒灭活疫苗免疫小鼠后，注射疫苗剂量在3个分组中对分子表达影响不同：在Foxp3和CD4+CD25+组中，0.1 mL组平均值比对照组降低、0.3 mL组比对照组升高，表明随着注射疫苗剂量逐渐增加，对Foxp3和CD4+CD25+免疫分子表达有所影响；而在CD4+CD25+Foxp3组中，0.1 mL实验组平均值与对照组相比明显升高，其余时间点间无明显变化，表明低剂量注射流感疫苗就可引起CD4+CD25+Foxp3分子表达增强，因此该实验结果揭示CD4+CD25+Foxp3分子在机体免疫反应中发挥重要作用。

随着造模时间的延长，各时间点免疫分子表达平均值也不相同：Foxp3实验组第4、8、12、19、26、34天均无明显差别；CD4+CD25+实验组第34天比第4天有所下降，第8、12、19、26天与第4天相比均无明显差别；CD4+CD25+Foxp3实验组于注射第19、26天比第4天有明显升高。上述实验结果表明，只有CD4+CD25+Foxp3免疫分子对甲流病毒具有有效的免疫清除作用。

该研究发现，甲流疫苗免疫小鼠后出现机体免疫功能变化，使CD4+CD25+Foxp3 T细胞免疫功能增强，从而起到对抗甲流病毒对机体的免疫损伤的作用。因此本研究可以推断，甲型H1N1流感病毒感染的一个重要机制是引起CD4+CD25+调节性T细胞减少，打破机体免疫耐受状态，使机体免疫处于相对过激或亢进状态，而过度免疫可导致机体损伤。该研究结果与2009年甲流流行期间危重症患者的发病特点相吻合，临床报道通过检测危重症甲流患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞，发现该细胞含量明显降低。因此该研究得出结论，CD4+CD25+调节性T细胞减少是甲型H1N1流感病毒感染机体的一个重要免疫病理基础。

[1] 徐娟,颜学兵,周培培,等.甲型H1N1流感危重症患者淋巴细胞亚群和CD4CD25调节性T细胞的检测及其意义[J].中华实验和临床感染病杂志, 2011,5(1):27-35.

[2] 杨红,潘兴南,许正锯,等. 2009年秋冬季某部甲型H1N1患者流感淋巴细胞亚群分析[J].中华实验和临床感染病杂志,2011,4(4)：424-428.

[3] 张新伟.甲型H1N1流感患者淋巴细胞亚群检测结果分析[J].实用预防医学,2011,18(5)：823-824.

[4] Jiang TJ,Zhang JY,Li WG,et al.Preferential loss of Thy17 cells is associated with CD4 T cell activation in patients with 2009 pandemic H1N1 swine-origin influenza A infection[J].Clin Immunol,2010,137：303-310．

[5] Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M，et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor a-chains(CD25). Breackdown of single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases [J]. J Immunol, 1995,155(3): 1151-1164.

[6] Sakaguchi S.Regulatory T cells:key controllers of immunologic self-tolerance [J].Cell,2000,101(5):455-458.

[7] Sakaguchi S, kaguchi N, Shimizu J，et al. Immunologic tolerance maintained by CD25+CD4+regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance [J]. Immunol Rev, 2001,182(8): 18-32.

[8] Shevach E M. Certified professionals:CD4+CD25+suppressor T cells [J]. J Exp Med, 2001,193(11): 41-46.

[9] Shevach E M, McHugh R S, Piccirillo CA，et al. Control of T cell activation by CD4+CD25+suppressor T cells[J]. Immunol Rev, 2001,182: 58-67.

[10] Stephens LA, Mottet C, Mason D, et al.Human CD4(+)CD25(+) thymocytes and peripheral T cells have immune suppressive activity in vitro[J]. Eur J Immunol,2001,31(4):1247-1254.

[11] Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, et al.The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3[J]. Nat Genet, 2001,27(1):20-21.

[12] Dawood FS，Jain S，Finelli L, et al. Emergence of a novel swine—origin influenza A(HIN1)virus in humans[J]. N Engl J Med,2009,360(25)：2605-2615.

[13] Perez-Padilla R, de la Rosa-Zamboni D, Ponce de Leon S, et al. Pneumonia and respiratory failure from swine-origin influenza A (H1N1) in Mexico[J]. N Engl J Med,2009,361:680-688.

[14] Cao B,Li Xw,Mao Y,et al.Clinical features of the initial case of 2009 pademic influenza A(H1N1)virus infection in china[J]．N EngI J Med，2009，36l：2507-2517．

[15] 吕进,王希良．流感病毒感染介导的免疫病理损伤研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2009,36(8):961-967.

[16] 王剑超,张永为,马春芳,等.甲型H1N1流感病例的血液学特点及临床分析[J].中华临床感染病杂志，2010,3(1)：19-22.