154例RhD阴性表型个体的D基因多态性分析

熊 莉，孙 瑜，李国良，唐 绮，肖 莉，吴 红，翁美芝

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

154例RhD阴性表型个体的D基因多态性分析

熊 莉，孙 瑜，李国良，唐 绮，肖 莉，吴 红，翁美芝

(江西省血液中心，江西 南昌 330077)

目的研究RhD阴性个体基因多态性。方法采用抗人球蛋白试验(IAT)确认RhD阴性个体；对RhD阴性个体再运用PCR-SSP方法分析其基因分布情况。结果154例IAT确定为RhD阴性的个体中，86例所检测的外显子完全缺全(55.84%)、36 例完整(23.38%)、32 例部分缺失(20.78%)；其检出 DelRhD1227A、弱 D15 型、RHD-CE(2～9)-D、DVa(Has)、DVIⅢ等多种RhD阴性等位基因。结论江西地区血清学RhD阴性人群中存在RHD基因且呈现多态性，提示可联合应用血清学和基因分型两种方法来检测D抗原。

RhD；基因；多态性；血型

Rh血型是人类最复杂和最具多态性的红细胞血型系统，该血型至少由57种不同的抗原组成。D抗原是免疫原性最强的Rh血型抗原，在临床输血、新生儿溶血等方面有重大意义。因此，鉴定RhD抗原表型被列为临床输血常规检查[1]。近年来，国内外研究发现不同种族在抗人球蛋白试验确认为RhD阴性的个体中仍存在RHD基因[2，3]，提示RhD阴性个体存在遗传多态性并具有广泛的种族背景差异。我们对江西地区154例RhD阴性样本进行血清学检测并应用PCR-SSP技术分析RHD基因型，以探讨江西个体RhD阴性的分子基础，以期发现其多态性规律。

1 材料与方法

1.1 研究对象 154份RhD阴性无亲缘关系的血液样本均取自江西省血液中心的健康无偿献血者。

1.2 血清学RhD阴性确认 对初筛为RhD阴性的标本采用抗人球蛋白试验，至少用3种以上抗D血清进行Rh阴性确认。(北京金豪,Lot:201109096，上海血液生物，Lot:20111212,Milliore,Lot：BMB1101J)

1.3 基因组DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，用Texas基因组DNA抽提试剂盒分离获得，-20℃保存待用。

1.4 Rh血型基因分型 采用天津市秀鹏生物技术开发有限公司的红细胞RHD阴性鉴定基因检测试 剂 盒 (检 测 RHD 基 因 1、5、6、7 外 显 子 ，Lot：1109，有效期：20120915)，对 154 例血清学确认为RhD阴性的标本进行检测。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像仪观察结果。

2 结果

154 例间接抗人球蛋白试验(IAT)确定为RhD阴性的个体中，86例所检测的外显子完全缺全(55.84%)、36 例 完 整 (23.38%)、32 例 部 分 缺 失(20.78%)； 其检出弱 D15型 1例 (0.65%)，Del-RhD1227A 型 26 例 (16.88%)，RhD+9 例 (5.84%)，RHD-CE(2～9)-D16 例 (10.39%)，DVa(Has)1 例(0.65%)，DVIⅢ1 例(0.65%)。 见表 1。

表1 表型RhD阴性个体RHD外显子及等位基因分析

3 讨论

Rh血型基因位于染色体 1p34.3～36.1，由RHCE和RHD两个高度同源结构基因组成，各含有10个外显子，二者核苷酸序列同源性高达96%。两基因差异最大的区域位于外显子4，5，7，10及内含子4，与RHCE基因相比，RHD基因内含子4中有1个649bp序列的缺失。

目前发现欧洲白种人以高加索人为代表，绝大多数完全缺失RHD基因，属最常见型，这也代表了绝大部分RhD阴性的机制；非洲黑人则以RHDψ基因、RHD-CE-D杂交基因这两种情况为主；在东亚黄种人中，特别是日本人、韩国人、中国台湾、香港和大陆人主要有3种情况：RHD基因完全缺失、RHD基因部分缺失、RHD基因完整无缺失。其中RhD阴性基因多态性表现为RHD-CE(2～9)-D2、DEL(1227A)、RHD710delC、RHD(M295I)、RHD(X418L)等多种等位基因形式。

本研究显示，154份经抗人球蛋白试验确认为RhD阴性的样本中55.84%完全缺失D基因，23.38%D基因外显子完整,20.78%D基因部分缺失，与广东、福建报道的相关数据相似[4，5]。 其中RHD基因完整无缺失中以DEL(1227A)等位基因为主，占RhD阴性样本的16.88%。DEL(1227A)是RHD基因第9外显子最后1个碱基发生突变即1227G>A，导致正常的RHD基因读码框发生改变从而影响了mRNA的拼接导致Rh抗原的表达异常。我国人群中，97.1%的DEL型为l227G>A突变，这为PCR-SSP检测其突变位点提供了良好的平台，因此基因分型方法已成为未来检测DEL型的趋势[6]。另外，还发现有弱D15型、DVa(Has)、RHD-CE(2～9)-D、DVIⅢ等多种RhD阴性等位基因表现形式，与深圳地区RhD阴性基因型分布情况接近[7]。基因结构呈明显的多态性，这一结果与以往中国广东[8]、台湾[9]和海南[10]报道一致，表明不同地区中国人具有相同的Rh血型遗传背景。另外，还有14例标本未能确定RhD阴性的分子基础，可能与实验操作或试剂盒的局限性有关，将在以后的工作中确认完善。

近几年,研究者发现一些RhD阴性个体中能检出RhD基因,这些个体拥有D基因,却不表达D抗原,推测有两个方面的原因：一是RHD基因存在核苷酸片段的插入、缺失或者替换导致无义突变[8,11]，二是这些个体并非真实的RhD阴性，而是因D抗原较弱，吸收放散试验也未能检出，比如本研究中9例外显子表现为RhD阳性的阴性个体。

本研究说明在中国人中,RhD阴性个体RHD基因存在着多态性,针对白种人RhD阴性机制只测定几个外显子的RHD基因定型试剂盒并不适合中国人。因此当PCR-SSP出现无法解释的结果或需要确认具体的弱D型或部分D型别时，必须进一步通过RHD基因序列分析。在临床应用中，特别是在预测新生儿溶血病中要特别注意基因定型的假阳性和假阴性问题。鉴于输血医学关系到受血者的宝贵生命，不容丝毫差错，因此我们认为在中国RHD基因分型方法尚未成熟，在完全替代RhD表型血清学检测之前仍需对中国人RHD基因结构进行深入研究，以建立适合本地区人群RHD基因分型策略。

[1]杰夫·丹尼尔主编.朱自严主译.人类血型[M].北京:科学出版社,2007:259-260.

[2]Okuda H，Kawano M，Lwamoto S,et a1.The RHD gene is highly detectable in RhD-negative Japanese donors[J].J Clin Invest,1997,100(2):373-379.

[3]徐 群,张世训,张建业,等.中国汉族群体RhD阴性个体D基因外显子多态性研究[J].中华医学遗传学杂志,2001,18(1):39-42.

[4]周华友,兰炯采,王晓珠，等.人 RHD基因外显子多态性研究[J].第一军医大学学报，2004，24(5):513-516.

[5]卓传尚,卓孝福,郭永建，等.福建省RhD阴性个体RhD基因多态性[J].中国实验血液学杂志,2008,16(2):435-438.

[6]陆松松，陈静娴.Rh(D)变异体的研究进展[J].临床输血与检验,2010,12(4):374-377.

[7]周一炎，邵超鹏.深圳地区献血者Rh表型和基因型分布调查[J].临床输血与检验,2003,5(4):244-247.

[8]兰炯采,王从窑,魏亚明,等.中国汉族Rh血型基因多态性观察[J].中国实验血液学杂志，2003,11(6):642-645.

[9]Chen JC,Lin TM,Chen YL,et al.RHD 1227A is an important genetic marker for RhDel individuals[J].Am J Clin Pathol,2004,122:193-198.

[10]叶健忠,杨向萍,蔡于旭,等.海南汉族RhD阴性个体RHD基因研究[J].中国输血杂志,2005,18(2)：97-100.

[11]Avent ND,Martin PG,Armstrong-Fisher SS,et al.Evidence of genetic diversity underlying RhD,weak D and partial D phenotypes as determined by multiplex polymerase chain reaction analysis of the RHD gene[J].Blood,1997,89(7):2568-2577.

R457.1+1,Q346+.5

A

1674-1129(2012)04-0340-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.006

江西省卫生厅科技资助(20082010)

熊莉，女，1982年出生，硕士，主治医师，主要从事输血医学研究。