AMD3100动员造血干祖细胞作用的量效关系

饶彪锋，黄内红

(太仓市第一人民医院，江苏 太仓 215400)

AMD3100动员造血干祖细胞作用的量效关系

饶彪锋，黄内红

(太仓市第一人民医院，江苏 太仓 215400)

目的探讨AMD3100动员造血干祖细胞动员作用的量效关系。方法40只实验小鼠分为A、B、C、D、E五组，A组皮下注射等体积的生理盐水；B、C、D、E组分别皮下注射AMD3100 1.25、2.5、5、10mg/kg。2h后尾静脉取血，分别检测外周血白细胞计数、KSL细胞数及KL细胞。结果用药后B、C、D、E组白细胞KSL及KL细胞均比用药前升高(P<0.05)，随着用药剂量升高，白细胞、KSL细胞及KL细胞数逐渐升高，当剂量达到5 mg/kg时达到作用高峰。结论AMD3100对造血干/祖细胞动员作用随着剂量增大而加强，有一定的剂量依从关系。

动员；造血干/祖细胞；KSL细胞

我们之前的试验发现AMD3100对KSL/KL细胞有一定的动员作用，并发现它动员速度快，作用时间短[1]。本试验进一步探讨它的量效关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 AMD3100、云南白药、红细胞裂解液分别购买于Sigma公司、云南白药集团及BD Biosciences公司,FACS Calibur流式细胞仪由BD Biosciences公司生产。抗体PerCP-Cy5.5-anti mouse CD45、APC-anti mouse Sca-1、PE-anti mouse c-kit、FITC-anti-mouse CD45RB220 、FITC-anti –mouse Mac-1、FITC-anti-mouse Gr-1 、FITC-anti-mouse CD4α 、FITC-anti-mouse CD8 、FITC-anti-mouse Tre119购买于Biolegend公司，

1.2 实验动物 C57BL/6小鼠，10～14周龄，为清洁级近交系小鼠，来自江苏省扬州大学实验动物中心。

1.3 主要试剂配制 anti-Lin(1：20)抗体由等量的FITC -anti mouseCD45RB220、FITC -anti mouseMac-1、FITC-anti mouseGr-1、FITC-anti mouseCD4、FITC-antimouseCD8 及 FITC-anti mouseTre119原液均匀混合并加20倍体积的蒸馏水配制而成。

1.4 实验分组及给药方法 C57BL/6小鼠随机分入A、B、C、D、E组，每组8只。A组腹部皮下注射等体积的生理盐水；B、C、D、E组分别腹部皮下注射AMD3100 1.25、2.5、5、10mg/kg。

1.5 检测指标

1.5.1 外周血白细胞计数 各组动物均于注药2h后尾静脉血10μl加入390μl 2%的醋酸溶液中，混匀后利用显微镜显微镜进行WBC计数。

1.5.2 外周血KSL细胞及KL细胞计数 各组动物均于注药 2h后尾静脉血 30μl，加入 PerCPCY5.5-anti mouse CD45 单 抗 3μl、Lin 混 合 抗体3μl、APC-anti mouse Sca-1 单抗 3μl、PE-anti mouse c-kit单抗 3μl，充分混匀，避光孵育 20 min；分别加入红细胞裂解液0.5ml，充分混匀，避光孵育 6 min；PBS 洗涤一次，2000r/min 离心 3min，随后上机测定。用流式细胞术检测KSL细胞及KL细胞并分析其所占比例。外周血WBC数×KSL细胞所占的比例即为外周血KSL细胞计数，外周血WBC数×KL细胞所占的比例为外周血KL细胞计数。

1.5.3 统计学处理 采用SPSS 11.5软件包进行统计分析,实验数据以±s表示，对数据进行方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量AMD3100动员前后外周血白细胞计数的变化 A组用药前后白细胞数差异无明显变化(P>0.05)，动员后 B、C、D、E 组白细胞明显高于用药前 (P<0.05)，D组白细胞数明显高于 B组及 C组(P<0.05)，D组、E组两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。当剂量达到5 mg/kg时达到作用高峰(详见表 1)。

2.2 不同剂量AMD3100动员前后外周血KSL细胞及KL细胞计数的变化 外周血KSL细胞及KL细胞计数的变化趋势相同，A组用药前后KSL细胞数及 KL 细胞计数无明显变化(P>0.05)，B、C、D、E组用药后KSL细胞及KL细胞计数明显高于用药前 (P<0.05)，D组KSL细胞数及KL细胞计数明显高于B组及 C组(P<0.05)，D、E两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。当剂量达到5 mg/kg时达到作用高峰(详见表2)。

表1 注射不同剂量的AMD3100后外周血白细胞计数（n=8，±s,×109/L）

表1 注射不同剂量的AMD3100后外周血白细胞计数（n=8，±s,×109/L）

注：▲P<0.05

组别 动员前 动员后A组B组C组D组E组12.5±1.4 13.0±1.3 12.3±1.2 12.3±1.1 12.4±1.5 13.4±1.2 29.1±4.3▲46.7±5.3▲101.2±9.3▲94.3±8.7▲

表2 注射不同剂量的AMD3100后外周血KSL/KL细胞计数（n=8，±s）

表2 注射不同剂量的AMD3100后外周血KSL/KL细胞计数（n=8，±s）

注：▲P<0.05

动员前动员后组别 KSL cell（×105/L） KL cell（×106/L） KSL cell（×105/L） KL cell（×106/L）A组B组C组D组E组7.9±1.4 8.1±1.5 7.8±1.4 7.9±1.6 7.8±1.5 32.4±1.3 29.9±1.9 31.7±1.6 30.5±1.5 32.3±1.4 8.0±1.3 23.1±3.1▲46.7±5.3▲126.0±12.5▲130.2±10.7▲32.0±1.1 58.1±3.0▲143.7±3.9▲389.3±14.7▲397.6±12.5▲

3 讨论

造血干细胞移植主要包括骨髓移植、外周血干细胞移植、脐血干细胞移植及胎肝移植等，早期主要以骨髓为主，近年来外周血干细胞移植发展较快，大有取代骨髓的趋势。外周血中干细胞量极少，需用动员剂刺激干细胞动员到外周血后才能采集到足够的干细胞，粒细胞集落刺激因子是最常用的动员剂，但它有费时、作用持续时间短等缺点，更为严重的是有部分个体对它不敏感，不能动员出足够的干细胞[2]，因此探索新的造血干细胞动员方法已经成为研究热点。

黏附分子CXCR4与其配体基质细胞衍生因子(SDF-1)相互作用在HSC/HPC的动员、归巢、增殖、分化中发挥重要作用[3，4]。骨髓基质细胞表面有大量的SDF-1表达，而CXCR4在HSC/HPC及多种成熟血细胞表面都有表达，黏附分子SDF-1与其配体CXCR4结合可促使HSC/HPC黏附在骨髓微环境中。AMD3100的作用机制主要与黏附分子CXCR4和它的配体基质细胞衍生因子 (SDF-1)的相互作用有关：CXCR4拮抗剂AMD3100能够和SDF-1竞争CXCR4受体，竞争性阻断SDF-1与CXCR4的结合，从而动员HSC/HPC迁徙到外周血中[5]。

研究表明在小鼠中KSL细胞 (c-kit+Sca-1+lin-细胞)有极强的多向分化及自我更新和多向分化能力，100个这种细胞植入小鼠后就可以完成长期造血重建及免疫重建，目前认为在小鼠中KSL细胞群中含大量的HSC,KL(c-kit+lin-细胞)细胞群中富含较原始的HPC及HSC[6,7]。因此可以通过检测KSL细胞及KL细胞来反映小鼠外周血HSC和HPC的数量。

本实验发现随着AMD3100剂量增大外周血白细胞、KSL细胞及KL细胞数也随着上升，当剂量上升到5mg/kg时达到作用平台，再增大用药剂量动员效果不增强。受体学说认为当药物剂量增大时，与之结合的受体增多，因而药物的作用增强，药物浓度进一步增大使受体达到饱和后再增大药物剂量药物作用将不再增强[8]。AMD3100的这种作用特点与受体学说相符合。

本实验发现AMD3100对HSC/HPC有动员作用，并表现为剂量依从关系。但它与粒细胞集落刺激因子联用是否有协同作用？它动员出的HSC/HPC是否能完成免疫重建和造血重建？这些问题有待进一步探索。

[1]饶彪锋,潘秀英,陆 晔,等.AMD3100动员造血干/祖细胞的实验研究[J].江苏医药，2012，38(5)516-518.

[2]Larochelle A,Krouse A,Metzger M,et al.AMD3100 mobilizes hematopoietic stem cells with long-term repopulating capacity in nonhuman primates[J].Blood,2006,107(9),3772-3778.

[3]Shi M,Li J,Liao L,et al.Regulation of CXCR4 expression in human mesenchymal stem cells by cytokine treatment role in homing efficiency in NOD/SCID mice[J].Haematologica,2007，92(7):897–904.

[4]Liu X,Duan B,Cheng Z,et al.SDF-1/CXCR4 axis modulates bone marrow mesenchymal stem cell apoptosis,migration and cytokine secretion es[J].Protein Cell.2011;2(10):845-854.

[5]Kollet O,Petit I,Kahn J,et al.Human CD34(+)CXCR4(-)sorted cells harbor intracellular CXCR4,which can be functionally expressed and provide NOD/SCID repopulation[J].Blood,2002,100(8):2778-2786.

[6]Matsuzaki Y,Kinjo K,Mulligan RC,et al.Unexpectedly efficient homing capacity of purified murine hematopoietic stem cells[J].Immunity.2004,20(1):87-93.

[7]Okada S,Nakauchi H,Nagayoshi K,et al.In vivo and in vitro stem cell function of c-kit-and Sca-1-positive murine hematopoietic cells[J].Blood,1992,80:3044–3050.

[8]Derendorf H.Receptor-based pharmacokinetics-pharmacodynamic analysis of corticosteroids[J].Clin Pharmacol,1993,33:115-123.

Dose-effect relationship of AMD3100 on mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells

RAO Biaofeng,HUANG Neihong.The First People's Hospital of Taicang,Jiangsu Taicang 215400,China

ObjectiveTo observe the different mobilization effects of hematopoietic stem and progenitor cells by different dosages of AMD3100.MethodsForty C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups,group A,B,C,D and E.The mice in group A were injected with saline,and the mice in group B,C,D and E were injected with 1.25,2.5,5,10 mg/kg AMD3100 respectively.The peripheral blood was collected 2 h after injection,and the WBC,KSL and KL cells were counted.ResultsThe numbers of peripheral WBC,KSL and KL cells in group B,C,D and E were all increased after injection,and with dose increasing,the numbers of WBC,KSL and KL cells were all increased,and the maxmium mobilization occurred at the dosage of 5 mg/kg AMD3100.ConclusionThe mobilization effect of AMD3100 shows the dose-dependent relationship in a specific concentration range.

Hematopoietic stem and progenitor cells;KSL cells;Mobilization

R331

A

1674-1129(2012)04-0337-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.005