线性探针技术用于快速筛查耐多药结核病的研究

时金艳，李铁成,夏荣荣,许卫国

(1、连云港市第四人民医院，江苏 连云港 222000;2、江苏省疾病预防控制中心慢传科，江苏 南京210009)

线性探针技术用于快速筛查耐多药结核病的研究

时金艳1，李铁成1,夏荣荣1,许卫国2

(1、连云港市第四人民医院，江苏 连云港 222000;2、江苏省疾病预防控制中心慢传科，江苏 南京210009)

目的评价线性探针技术(LPA)快速筛查临床耐多药结核病人的效能。方法应用病例对照研究方法，连续收集326例临床涂阳病人的痰标本，进行传统比例法药物敏感性试验和线性探针技术检测利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药性，分析线性探针方法对诊断耐多药结核病的敏感度和特异度。结果以比例法为参照，线性探针技术诊断耐多药结核病的敏感度为70%，特异度为97%，结果无显著性差异，报告结果时间为20d，明显低于传统药敏试验报告时间。结论线性探针耐多药检测技术特异性高，快速便捷，可以用于临床耐多药结核病诊断。

线性探针技术；耐多药结核病

自1944年链霉素研究成功，结核病由无药可治到有药可治，并逐渐从长程化学药物治疗进入到短程化学药物治疗时代。由于防范控制的松懈与药物使用监督机制等的缺陷,有些结核病患者的疗程达2年以上，其根源是耐多药结核杆菌(MDRTB)[1]，耐多药(MDR-TB)和严重耐多药(XDR-TB)菌株的出现，使得结核病的有效控制更加难以实现。WHO已将中国列为耐药结核病“特别引起警示的国家和地区”之一，MDR-TB这一威胁全球的公共卫生问题已引起各国学者的广泛关注，成为新的研究热点[2]。

传统的结核菌耐药性检测方法为结核菌培养药敏试验，所需时间长，不利于临床的及时、正确诊断。近年来，随着分子生物学技术的发展，基于结核分枝杆菌耐药机制的研究进展，开发了多种快速检测结核菌耐药性的方法，如：基因芯片技术、线性探针杂交检测等方法，大大缩短了检测周期，有利于临床医生的早期诊断和治疗方案的确定，一定程度上也减轻了患者的治疗费用负担。线性探针技术操作简单易行，采用试纸条杂交技术，通过检测最常见的rpoB和katG/inhA基因突变，确定结核分枝杆菌对利福平(rifampicin,RFP)和异烟肼(isoniazid,INH)的耐药性[3]，可以在24h内出结果。本研究通过用该方法检测326例临床涂阳结核病人的痰标本，评价其在医院快速筛查MDR结核病的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究对象 来自连云港市区及所辖区县的初诊涂阳结核病人的涂阳痰标本。

1.1.2试剂 MTBDR-Plus Kit(Hain life science,Germany),高保真热启动酶 (HotStar Taq酶，Qiagen)。

1.2 方法

1.2.1 采用病例对照方法，对所有入选标本同时进行罗氏培养基比例法药敏试验和线性探针技术检测。

1.2.2 比例法药敏 参照WHO/IUATLD标准，培养采用中和离心法，培养阳性菌株，用接种环取一环培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对制成1 mg/ml菌悬液，梯度稀释为10-2和10-4mg/ml，分别接种含 RFP(40 μg/ml)和 INH(0.2μg/ml)的罗氏固体培养基，37℃培养6周后读菌落数，计算耐药百分比，耐药百分比≤1%为敏感(S)，>1%为耐药(R)。RFP和INH同时耐药为MDR，否则为非MDR。

1.2.3 核酸提取 1ml痰标本消化液，12000r/min离心5 min后，弃上清，加150μl无菌高纯水中，充分混悬沉淀，95℃水浴20 min，之后超声15 min,12 000r/min离心5 min后，将上清转移到另一管，取5μl用于PCR扩增，剩余-20℃保存备用。

1.2.4 PCR扩增 PCR扩增准备含有DNA聚合酶的扩增体系45μl，加5μl提取的 DNA模板，上机扩增:95℃ 15 min;95℃ 30s,58℃ 2 min,10个循环;95℃25s,53℃ 40s,70℃ 40s,20个循环；70℃ 8 min。直接取扩增产物20μl进行杂交检测。

1.2.5 杂交 扩增产物经过化学变性后，与带有探针固化的试纸条杂交，通过显色反应检测杂交。

1.2.6 结果判定 见图1RFP和INH突变检测图示，其中有3个质控探针，1个探针(AC)是扩增对照，用于质控扩增系统;1个探针(CC)是用于质控显色反应;1个探针是特异检测23rRNA基因(tub)。并且有24个检测探针，1个探针是特异性检测rpoB基因，8个rpoB野生位点探针，4个rpoB常见突变位点探针;1个探针特异性检测katG基因，1个katG野生位点探针，2个katG突变位点探针;1个探针特异性检测inhA基因，2个inhA野生位点探针，4个inhA突变位点探针。当任一基因的野生位点出现显色缺失，并且突变位点有显色时，认为是发生了突变，判定为耐药;野生位点未缺失，突变位点未显色，判定为敏感。如果扩增对照或tub对照条带缺失，需要重复实验;显色反应条带较浅时不需重做。

1.2.7 结果分析 应用STATA8.0软件进行数据处理。对两种方法检测阳性痰标本的耐药性检测比较采用配对四格表资料的χ2检验，P<0.05为有统计学意义。

图1 RFP和INH突变检测图示

2 结果

2.1 线性探针技术与传统药敏方法检测耐多药结果分析 两种方法检测阳性临床痰标本的结果：比例法对MDR TB检出率为17.18%(56/326)，MTBDR-Plus方法对MDR-TB检出率为14.72%(48/326)，通过配对四格表资料的χ2检验可见，两种方法检测耐多药结核病的差异无统计学意义，符合度一致。

2.2 线性探针技术检测利福平和异烟肼耐药性的效能 以比例法药敏结果为标准，线性探针技术检测利福平的灵敏度为86%，高于异烟肼的灵敏度76%，检测利福平和异烟肼的特异性分别为93%和95%。

2.3 线性探针技术诊断耐多药结核病的效能 以比例法药敏结果为标准，线性探针方法检测MDR结核病的敏感度为70%(39/56)，特异度为97%(261/270)，阳性预测值81%(39/48)，阴性预测值94%(261/278)，见表 3。

2.4 线性探针技术检测 MDR TB的报告时间比较痰标本从区县运输到地市级实验室的中位数为3d，线性探针检测报告耐药结果时间的中位数为20d，明显低于传统药敏试验结果时间的中位数66d。线性探针检测随着工作熟练，检测报告时间逐步缩短，最短为6d。

3 讨论

耐药结核病的早期诊断对控制耐药结核病的传播有重要意义。传统药敏试验花费时间长，不能满足临床需要。随着分子生物学的发展，近年来涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的耐药性检测，基于PCR原理的线性探针方法操作简单，可以直接检测涂阳痰标本，在一个工作日完成耐药性检恻，极大缩短了耐药性报告时间[4]。

本研究采用临床涂阳结核病人的痰标本作标本，提取核酸DNA,PCR扩增后，通过反相杂交检测突变检测耐药性。研究结果显示，LPA检测利福平和异烟肼的灵敏度分别为86%和76%，检测利福平和异烟肼的特异性分别为93%和95%，与李强等研究结果相似[5]。线性探针技术检测耐多药结核病的敏感度达到70%，特异度达97%，准确性为81%，统计学结果充分表明，比例法和线性探针方法在检测结核分枝杆菌对RFP和INH的药物敏感性的差异无统计学意义。此外，线性探针技术检测报告时间较传统药敏大为缩短，虽然线性探针技术操作可以在1个工作日完成，但是由于病人痰标本需要从区县运输到地市级实验室，实际上报告时间往往需要更多时间，研究结果显示，线性探针平均检测时间为20d，远小于传统药敏结果报告的66d。但随着工作人员的操作熟练以及流程的熟悉，在研究后期线性探针报告时间缩短至6d，极大缩短了病人耐药诊断时间，具有一定的临床应用和推广价值。此外，我们的研究表明菌株冻存的时间不会影响实验结果，可使用保存的菌株来开展耐药性检测。需要注意的是，环境中的核酸可能会对实验结果产生影响，这对于实验室的环境提出了更高的要求。

表1 两种方法检测耐多药结核病的情况

表2 线性探针技术与比例法检测利福平和异烟肼耐药性结果的比较

表3 线性探针技术与比例法检测MDR TB结果的比较

表4 传统药敏和线性探针检测时间比较

耐多药结核病是当前全国结核病控制的重点，快速耐药诊断可以为耐多药结核病人的早期治疗提供科学依据，本研究结果显示连云港市初诊涂阳肺结核病人中耐多药率为15.77%，明显高于全国水平。如果应用新的快速耐药检测技术，将对本市未来耐多药结核病控制具有重要意义。

[1]World Health Organization.Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis[S].WHO/TB,1996.

[2]World Health Organization/IUATLD.Global Working Group on Antituberculosis Drug Resistance Surveillance[S].Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis.WHO/IUATLD,1997.

[3]Hillemann D,Weizenegger M,Kubica T,et al.Use of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complex isolates[J].J Clin Microbiol,2005,43:3699-3703.

[4]Bang DA,Andersen B,Thomsen VO.Rapid genotypic detection of rifampin-and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis directly in clinical specimens[J].Clin Microbiol,2006,44:2605–2608.

[5]Li Q,Zhao YL.Study of MTBDR-Plus Assay for rapid detection of Rifampin and Isoniazid resistance using 197 clinical isolations[J].Zhong Guo Fang Lao Za zhi,2009,31(12)：719-721.

Research on line probe assay for rapid detection of MDR-TB

SHI Jinyan,LI Tiecheng,XIA Rongrong,et al.The Fourth People's Hospital of Lianyungang City,Jiangsu Lianyungang 222002,China

ObjectiveTo evaluate line probe assay on the detection of multi-drug resistant tuberculosis(MDR-TB)in clinical positive sputum specimens.MethodsA prospective case-control study was conducted to compare conventional drug susceptibility testing and line probe assay(LPA)by detection of rifampin(RFP)and isoniazid (INH)resistance in 326 clinical positive sputum specimens.The sensitivity and specificity of LPA were analyzed by comparing with conventional ratio drug sensitivity testing.ResultsThe sensitivity and specificity of LPA for MDR-TB detection was 70%and 97%,respectively.There was no significant difference between the two methods.The turnaround time of LPA was 20 days which was much shorter than that of traditional DST.ConclusionLine probe assay is a reliable simple method with high specificity and can be used for rapid detection of clinical MDR-TB.

Line probe assay;Multidrug resistance mycobacterium tuberculosis

R378.91+,R446.5

A

1674-1129(2012)04-0330-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.04.003

十一五国家科技重大专项(2011ZX10004-902)

时金艳，女，1972年1月出生，毕业于江苏大学医学检验专业，医学学士，主管检验师，研究方向：结核杆菌耐药测序。

许卫国,Email:jsjkmcr@163.com