静脉血和鼻咽分泌物EB病毒DNA检测结果的比较

陈 越， 王建国， 孙 午

(九江市第一人民医院,江西 九江 332000)

静脉血和鼻咽分泌物EB病毒DNA检测结果的比较

陈 越， 王建国， 孙 午

(九江市第一人民医院,江西 九江 332000)

EB病毒;荧光定量PCR;DNA

EB病毒 (Epstein-Barr Virus)是由Epstein和Barr发现的一种人类疱疹病毒，常引起传染性单核细胞增多症，多年来研究表明EB病毒与低分化鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤、Hodgkin’s病、 胃癌等恶性肿瘤的发生也有较密切的关系。目前临床检测手段主要是荧光定量PCR、血清学实验等。本论文主要应用荧光定量PCR探讨静脉血和鼻咽分泌物EB病毒DNA检测的比较研究。

1 材料与方法

1.1 材料Real-time PCR试剂盒购于全式金公司；PCR扩增仪购自达安7600；复星超净工作台；基因组DNA提取试剂购自Takara公司；RT-PCR试剂盒为Takara公司产品。

1.2 方法 同时收集2011年1至12月门诊和住院疑似 EB病毒感染的146例患者外周静脉血标本及鼻咽分泌物，所有研究个体静脉血均用一次性无菌注射器采集外周静脉血2ml，经枸橼酸钠抗凝，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。标本立即检测或－20℃冰箱保存6个月。咽拭子标本也要密闭送检。

1.2.1 DNA模板提取(1)鼻咽分泌物(咽拭子标本)，向玻璃管中加1ml灭菌 0.9%氯化钠溶液，浸泡咽拭子5min充分震荡均匀，挤干咽拭子，吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12000r/min离心5min;弃上清，沉淀中加入 50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理 10min，12000r/min 离心 5min，备用。(2)取全血1ml至干燥玻璃管中，加入1ml灭菌0.9%氯化钠溶液轻摇混匀;取干燥玻璃管加入500 μl淋巴细胞分离液;将稀释好的全血用移液器加入加有淋巴细胞分离液的试管中;2 000r/min离心20min，吸取白细胞层(从上至下的第二层)，加入1.5ml离心管中，12000r/min离心5min去上清，沉淀中加入 50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理 10min，12000r/min离心5min，备用。

1.2.2 PCR程序与PCR反应管中加入5μlDNA模板提取液，扩增体系总容量为 30μl，用已知 EBVDNA含量的标准阳性对照品制备标准曲线，同时设置阳性和阴性对照，置于自动荧光PCR仪上，93℃ 预变性 2min， 进入循环，93℃ 45s，55℃ 60s，10 个循环,93℃ 30s，55℃ 45s，30 个循环，一共 40个循环。

1.3 统计学分析 判定标准:增殖曲线不成S型曲线或Ct值无任何数值为阴性结果，Ct值＜38为阳性结果，38≤Ct值＜40为检测灰区，重新检测 2次，复检2次Ct值无为阴性结果，复检2次其中至少一次Ct值＜40为阳性结果。实验数据使用SPSS13.0软件进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

疑似EB病毒感染患者鼻咽分泌物标本阳性检出44例(64)，静脉血阳性检出6例(61)，两者有显著差异(P<0.05)，见表 1。

3 讨论

表1 疑似EB病毒感染患者不同类型标本检测结果

EB病毒感染引发的相关疾病多样，包括肿瘤性和非肿瘤性等，因此临床症状也具多样性临床症状，例如发热、咽喉痛、肝脾和淋巴结肿大等。现在EB病毒感染研究逐渐引起大家的重视。EB病毒是疱疹病毒γ亚科嗜淋巴细胞病毒属的 DNA病毒，在人群中广泛发病，虽多呈散发性，但也可引起广泛流行。EB病毒主要通过唾液传播，经输血也可传染[1]。

EB病毒首先在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。EB病毒后仅能在B淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EB病毒活化形成得复发感染。EB病毒长期潜伏在淋巴细胞内，是以环状DNA形式游离在胞浆中，并整合在染色体内。实时荧光定量PCR已广泛应用于感染性疾病病原体的检测和诊断[2,3]，用来检测EB病毒DNA具有高灵敏度和高特异性，可以在感染早期明确病因，准确及时地反映其在体内的消长情况，因此成为检测EB病毒的主要常用方法。

我们使用实时荧光定量PCR检测结果证实鼻咽分泌物EB病毒的检出率远远高于静脉血EB病毒的检出率，说明EB病毒大量存在于唾液腺及唾液中，有研究表明鼻咽癌患者EB病毒主要来自鼻咽上皮，只有少量分布于外周血白细胞中，我们实验充分印证此点。在临床采集标本做EB病毒检测时取材十分重要。所以鼻咽分泌物标本来源较好，不但阳性率较血液标本高，且阳性拷贝数鼻咽分泌物远高于血液标本，而且标鼻咽分泌物标本采集方便，更易于收集，所以我们建议临床需检测EB病毒尽量取鼻咽分泌物。虽然我们从鼻咽分泌物中检出EB病毒阳性率较血液标本,但其来源或释放的机制尚不十分清楚,可能与该法收集的鼻咽分泌物带有较多脱落白细胞有关，也可能因病毒在鼻咽部发生持续性整合感染或者由凋亡的肿瘤细胞释放所致，有待我们进一步研究。

[1]李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社,2007:291-298.

[2]吕世琪,张金良,闫 奇.乙肝五项指标与荧光定量PCR检测血清HBV-DNA含量联合运用[J].实验与检验医学,2011,29(6):641-642.

[3]白雪娟,杨 敏,赵澄泉,等.对ASC-H的妇女行高危人乳头状瘤病毒DNA检测的临床意义[J].实验与检验医学,2010,28(1):3-5.

R446.62，Q523+.3

B

1674-1129(2012)05-0498-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2012.05.033