稳心草黄酮类化合物对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及血管紧张素Ⅱ的影响*

2012-01-12窦志强戴恩来薛国忠

中医研究 2012年9期

关键词：黄酮类平滑肌抑制率

窦志强，戴恩来，薛国忠

(1.定西市人民医院，甘肃定西 743000;2.甘肃中医学院，甘肃兰州 730000;3.甘肃中医学院附属医院，甘肃兰州 730020)

稳心草黄酮类化合物对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及血管紧张素Ⅱ的影响*

窦志强1，戴恩来2，薛国忠3

(1.定西市人民医院，甘肃定西 743000;2.甘肃中医学院，甘肃兰州 730000;3.甘肃中医学院附属医院，甘肃兰州 730020)

目的：通过观察稳心草黄酮类化合物对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平变化的影响，探讨其防治肺动脉高压的物质基础和作用机制，为中药开发提供基础研究资料。方法：稳心草品种由药学专家进行植物基源鉴定，稳心草黄酮类化合物委托甘肃中医学院科研中心提取并鉴定。用原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，采用四氮唑蓝比色法(MTT法)测定细胞增殖，采用放射免疫法检测细胞外AngⅡ含量的变化。结果：稳心草黄酮类化合物对体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞有抑制增殖的作用，与空白对照组对比，差别有统计学意义(P＜0.05);稳心草黄酮类化合物各剂量组AngⅡ含量低于空白对照组，差别有统计学意义(P＜0.05)，且AngⅡ含量降低的程度与药物剂量呈一定的正相关。结论：稳心草黄酮类化合物对体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞有抑制增殖的作用，机制可能是其通过对AngⅡ的抑制，此可能是稳心草黄酮类化合物具有一定的降低肺动脉高压作用的原因之一。

稳心草黄酮类化合物/药效学;肺动脉平滑肌细胞/药物作用;血管紧张素Ⅱ;细胞增殖;肺动脉高压;细胞培养

肺动脉高压是一类以肺血管阻力进行性升高为主要特征的疾病。大量研究证明：肺动脉高压与肺血管结构重塑显著相关。研究肺动脉平滑肌细胞增殖的机制，是探讨低氧肺动脉高压、慢性肺原性心脏病及其他血管疾病发生机制的重要方向;而抑制肺动脉平滑肌细胞增殖，成为治疗低氧性肺动脉高压的一个重要思路。AngⅡ为刺激血管平滑肌细胞迁移和增殖的强效收缩因子，对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)迁移和增殖、促进新内膜形成起重要作用。本实验通过观察稳心草黄酮对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及血管紧张素Ⅱ的影响，为该药治疗肺动脉高压提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

3月龄健康SPF级Wistar雄性大鼠20只，购于甘肃中医学院SPF级实验动物中心，质量(180±20)g，质量合格证号 SCXK(甘)2004－007－0001542。动物饲养环境SPF级，合格证号SYXK(甘)2004－006－0001597。

1.2 药品、试剂与仪器

稳心草，购自甘肃宕昌，经甘肃中医学院生药学教研室李成义教授鉴定为正品;稳心草黄酮类化合物，由甘肃中医学院科研中心生药研究室提取，该药稳心草总黄酮的含量是735 g/L。四氮唑蓝(MTT)试剂，华美生物工程公司产品;十二烷基磺(硫)酸钠(SDS)，购自兰州鹏程生物公司;二甲基亚砜分析纯，天津化工试剂厂产品;台盼蓝，购自北京中山生物技术有限公司;碘化丙啶PI，购自华美生物工程公司;DMEM培养基、谷氨酰胺(L-glutamine)、胰蛋白酶粉(1∶250)及Ⅱ型胶原酶，购自美国Gibco公司;新生牛血清，购自杭州四季青生物工程有限公司，批号060513;青霉素钠，华北制药厂产品，批号A051212006;链霉素，哈尔滨制药六厂产品，批号050408;碘(125I)血管紧张素Ⅱ放射免疫分析药盒，购自北京科美东亚生物技术有限公司。奥林巴斯IX71型倒置相差光学显微镜，日本Olympus公司;JEM－1230透射电镜，产地日本;LKB-V超薄切片机，产地瑞典;XL型流式细胞仪，美国Coulter公司;RT2100型酶标仪，美国雷杜产品;DG－5031型酶标仪，国营华东电子管厂区产品。

1.3 细胞培养

断颈处死大鼠，以750 g/L乙醇浸泡消毒2 min;迅速分离取出肺动脉，以PBS液清洗去除血污，获干净光滑的管段;用眼科镊固定血管段端，刀片轻刮去除外膜结缔组织;用眼科剪小心剖开血管，刮去内膜层细胞;将血管段剪成1 mm3大小的组织块，均匀贴放于25 mL培养瓶底面，组织块隙约2～3 mm;加入体积分数为20%的新生牛血清的DMEM培养液2～3 mL，轻晃培养瓶使培养液掠过组织块，翻转静置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中3～5 h;再次翻转培养瓶使组织块浸没于培养液中，半开放式绝对静置培养3 d;3～5 d时首次换液［7］;于第5～7天，在光镜下观察，有梭形的细胞从组织块边缘长出;于第10～12天长成密集的不均匀的单层或多层细胞。

1.4 实验分组

分药物组和空白对照组6组：药物组分别加入不同剂量的稳心草黄酮，空白对照组加入等量的PBS。

1.5 检测指标

1.5.1 肺动脉平滑肌细胞

采用增殖四氮唑蓝比色法(MTT法)测定。取处于对数生长期的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMC)，镜下观察细胞长势良好。用移液器吸去培养液，加入PBS缓冲液液3 mL清洗细胞两次;加入1.25 g/L胰蛋白酶消化液2～3 mL，置于倒置相差光学显微镜下观察;待细胞回缩，细胞间隙增大时翻转培养瓶，使胰蛋白酶脱离细胞，吸除消化液，加入含体积分数为10%新生小牛血清的DMEM培养液4～6 mL终止消化，并轻轻吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液，台盼蓝排斥试验测定细胞活力，镜下细胞计数细胞活力在95%以上。将细胞混悬液移入离心管以2000 r/min离心10 min，细胞计数调整为1×105/mL，接种于96孔培养板。每板接种5个不同药物剂量的药物组和1个空白对照组，共6个组。每组设6个复孔，每孔加入90 μL细胞悬液，置于37℃、体积分数5%CO2常氧细胞培养箱常规培养24 h细胞贴壁后，待细胞生长基本汇合后小心吸除孔中培养液及药物;各药物组分别在细胞培养液中加入不同剂量稳心草黄酮类化合物10 μL，空白对照组在细胞培养液中加入等量的PBS，调零孔只加等量的培养液(无细胞)，全湿条件下，37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养;分别于加药后24，48，72及96 h在各孔加入MTT 10 μL;继续培养4 h，分别在各孔中加入100 μL十二烷基硫酸钠(SDS)终止培养;12 h后，待结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm处的吸光度(OD)值，按下式计算细胞抑制率。

1.5.2 AngⅡ含量

①原理：采用液相竞争放射免疫分析法，直接测定血浆中血管紧张素Ⅱ的含量。先将校样品(或样品)、标记物和抗体按操作程序依次加入试管中，使标记和非标记抗原与有限量抗体互相竞争结合，待反应平衡后，加入分离剂，离心沉淀，使游离抗原与抗原抗体复合物分离，测定沉淀物的放射强度。随AngⅡ含量增加，其放射性强度则相应降低。

②方法：采用放射免疫法检测。将圆底聚苯乙烯试管编号(复管)，按碘(125I)血管紧张素Ⅱ放射

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数()±标准差(s)表示，多组间均数比较用单因素方差分析和q检验。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 稳心草黄酮类化合物对PASMC增殖的影响

稳心草黄酮类化合物50 mg/L抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的作用不明显，随着剂量的增大，稳心免疫分析药盒上的加样测定程序表方法操作，操作要求在冰水浴中进行。数据处理：以B/B0为纵坐标，以校准品浓度为横坐标，在Logit－Log坐标纸上绘制校准曲线，根据样品B/B0，从校准曲线上查出样品的含量，用自动r计数仪预先编制的程序直接给出有关参数、校准曲线及样品浓度。草黄酮类化合物作用于 PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h，均有抑制PASMC增殖的作用;从抑制率看，药物浓度与抑制PASMC增殖程度成正相关。比较同一剂量下，稳心草黄酮类化合物作用于 PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的抑制率结果，提示稳心草黄酮类化合物作用于PASMC 48 h时其抑制平滑肌细胞增殖的效果最明显，抑制率为23.48%。见表1～2。

表1 稳心草黄酮类化合物作用于PASMC 48 h的MTT 结果分析 n=6，±s

注：与空白对照组对比，*P ＞0.05，＊＊ P ＜0.05。

组别8 h A 抑制率/%空白对照组0.400 ±0.023 0.00稳心草黄酮类化合物50 mg·L －1组 0.394±0.027* 1.51稳心草黄酮类化合物100 mg·L －1组 0.377±0.039* 5.75稳心草黄酮类化合物200 mg·L－1组 0.340±0.033＊＊ 15.12稳心草黄酮类化合物400 mg·L－1组 0.327±0.045＊＊ 18.25稳心草黄酮类化合物800 mg·L －1组 0.313±0.015＊＊21.75

表2 稳心草黄酮类化合物作用于PASMC 24 h、48 h、72 h、96 h的MTT结果分析 n=4，±s

注：与空白对照组对比，＊＊ P＜0.05。

组别/%正常对照组 0.396 ±0.124 0.00 0.553 ±0.027 0.00 0.693 ±0.0 24 h A 抑制率/%48 h A 抑制率/%72 h A 抑制率/%96 h A 抑制率37 0.00 0.817 ±0.051 0.00稳心草黄酮类化合物200 mg·L －1组 0.345±0.018＊＊ 12.96 0.465±0.030＊＊ 15.93 0.604±0.026＊＊ 12.93 0.752±0.026 8.01稳心草黄酮类化合物400 mg·L －1组 0.339±0.043＊＊ 14.38 0.448±0.015＊＊ 19.01 0.576±0.035＊＊ 17.03 0.745±0.044 8.87稳心草黄酮类化合物800 mg·L －1组 0.329±0.033＊＊ 17.05 0.423±0.049＊＊ 23.48 0.560±0.028＊＊ 19.27 0.732±0.036＊＊10.42

2.2 稳心草黄酮类化合物对细胞外AngⅡ含量的影响

与空白对照组对比，稳心草黄酮类化合物各剂量组AngⅡ含量降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。结果显示：AngⅡ降低的程度与药物剂量呈正相关。见表3。

表3 稳心草黄酮类化合物对细胞外AngⅡ含量的影响n=5± s

注：与空白对照组对比，＊＊ P＜0.05。

组别 AngⅡ含量/(μg·L－1)正常对照组＊＊402.31 ±47.24稳心草黄酮类化合物200 mg·L－1组 334.68 ±23.51＊＊稳心草黄酮类化合物400 mg·L－1组 261.33 ±20.29＊＊稳心草黄酮类化合物800 mg·L－1组 211.40 ±15.54

3 讨论

肺动脉高压的多表现于中医学“肺胀”的全过程中，肺胀由多种慢性肺系疾病转归而成。肺动脉高压临床表现为胸部膨满，胀闷如塞，喘咳上气，痰多，烦躁、心慌，甚则见唇甲紫绀。病久可见面色晦暗，面唇紫绀，脘腹胀满，肢体浮肿，甚或昏迷、抽搐以至喘脱等危重症候。根据其症状表现与中医学“咳喘”“痰饮”“心悸”“水肿”“喘厥”等证有关。病因肺为华盖之脏，邪气首先犯肺，肺失宣降，发为肺病;久病肺虚为主，由于反复感邪，使病情进行性加重。病位在肺，日久不愈，反复发作，正气必衰，进而累及脾、肾、心等脏俱虚，可出现肺脾肾阳气衰微，气不化水，水饮凌心射肺而引起咳喘或喘脱及水肿。病理性质多由气虚、气阴两虚发展为阳虚，在病程中且可形成痰、饮、瘀等病理产物。临床常见痰浊壅肺、痰热郁肺、痰蒙神窍、肺肾气虚、阳虚水泛等5个证候，各证常可互相兼夹转化。肺气的宣降失常、痰饮内生、瘀血阻滞是肺动脉高压形成并伴随疾病全过程的基本病理机制。以肺胀来代替肺动脉高压加以讨论是比较合适的。目前肺动脉高压病理生理复杂，故其防治尚未取得突破性进展。

稳心草(Hypericum attenuatumChoisy.)，又名赶山鞭、黑点叶金丝桃［1］，为藤黄科金丝桃属植物，是民间常用的中草药，常用于心脏病的治疗［2］。有研究［3］证实：稳心草在改善慢性克山病患者症状的同时，还对肝脏肿大、浮肿、颈静脉充盈有一定效果，从而使心功能获得不同程度的好转。稳心草的化学成分主要为黄酮类化合物。顾丽贞等［4］测定全草中黄酮类化合物含量平均为1.67%，董建勇等［5］对从甘肃产稳心草的地上部分分离出了11种黄酮化合物。国内外学者［6］发现黄酮类化合物有多种药理作用，包括：①清除自由基、抑制细胞膜脂质过氧化，降低过氧化脂质含量、提高红细胞超氧化物歧化酶活性。②对心肌缺血引起的心功能紊乱有保护作用，增加冠脉血流及颈动脉流量，抗心肌及脑缺血。③防止血栓形成和抗血小板聚集。④抑制血管平滑肌细胞增殖和细胞外基质沉积。⑤降低血三酰甘油酯和提高高密度脂蛋白的含量。

本结果显示：稳心草黄酮类化合物在剂量较大时对肺动脉平滑肌细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，药物的最佳作用时间为48 h，此时抑制率为23.48%。稳心草黄酮类化合物能降低肺动脉平滑肌细胞外AngⅡ水平，两者呈正相关。此可能是其降低肺动脉高压的基础因素之一。

本研究为稳心草黄酮类化合物具有抑制肺动脉平滑肌细胞增殖提供了一定的实验依据，并为开发治疗肺动脉高压的中药新药提供了基础研究资料。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第五十卷第二分册［M］.北京：科学出版社，1990：69.

［2］江苏新医学院.中药大辞典：下册［M］.上海：上海人民出版社：1823.

［3］黑龙江省呼伦贝尔盟地方病防治研究所.稳心草对慢性克山病初步治疗观察［J］.黑龙江医药，1976，3：46 －48.

［4］顾丽贞，张宏彬.稳心草化学成分的研究［J］.植物学报，1980，22(2)：151.

［5］董建勇，贾忠建.赶山鞭中黄酮类化学成分研究［J］.中国药学杂志，2005，12(40)：897 －899.

［6］刘文丽，于鲁海，马燕.紫外分光光度法在黄酮类化合物含量测定中的应用［J］.新疆中医药，2006，24(3)：85 －86.

1001－6910(2012)09－0055－04

R285.5

10.3969/j.issn.1001 －6910.2012.09.029

戴恩来，教授，主任医师，医学博士，E-mail：daienlai@sohu.com