LY294002对阿霉素诱导的人乳腺癌上皮-间质转化作用的影响

钱玉珺，成向明，王 斌，徐 磊，武晨江，赵梦琳，戚晓红，郭 军

南京医科大学基础医学实验教学中心，南京 210029

LY294002对阿霉素诱导的人乳腺癌上皮-间质转化作用的影响

钱玉珺，成向明，王 斌，徐 磊，武晨江，赵梦琳，戚晓红，郭 军

南京医科大学基础医学实验教学中心，南京 210029

目的研究LY294002对阿霉素 (ADM)诱导的人乳腺癌细胞上皮-间质转化作用的影响。方法体外培养人乳腺癌细胞MCF-7，以ADM与或不与PI3K特异抑制剂LY294002共同处理，采用Western blot法检测Akt、p-Akt、Snail和E-cadherin蛋白水平的变化，RT-PCR检测Snail与E-cadherin mRNA的表达。结果ADM可通过磷酸化上调Akt活性，增加Snail蛋白水平及降低E-cadherin的表达 (P＜0.05)，LY294002预处理可逆转上述蛋白的活性和含量变化(P＜0.05)。结论LY294002可逆转ADM诱导的人乳腺癌上皮-间质转化，其可能是通过抑制PI3K/Akt通路参与Snail和E-cadherin表达调控来实现的。

阿霉素;LY294002;人乳腺癌细胞;上皮-间质转化

上皮-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)是多细胞生物胚胎发育的基础，是具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞过程。EMT以上皮细胞极性丧失及间质特性获得为重要特征，具体包括:细胞黏附分子 (如E-cadherin)表达减少;角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，从而引起细胞形态的改变［1］。最近，EMT在肿瘤的发生、浸润和转移中的作用引起人们广泛关注［2］。肿瘤的EMT与化疗耐药密切相关［3］，乳腺癌耐药细胞系及对紫杉醇耐药的卵巢癌细胞均有EMT改变［4-5］。本研究观察了 LY294002对阿霉素 (adriamycin，ADM)诱导的人乳腺癌细胞EMT作用的影响。

材料和方法

材料 人乳腺癌细胞MCF-7细胞株由南京医科大学细胞生物学系提供。阿霉素购自深圳海王药业公司，LY294002购自碧云天生物技术研究所，RPMI medium 1640购自美国Invitrogen公司，新生牛血清购自美国Hyclone公司，Akt抗体、磷酸化Akt抗体(Ser473)、E-cadherin抗体、Snail抗体购自北京博奥森生物技术公司，β-actin、Snail、E-cadherin引物由美国Invitrogen公司合成，Trizol与Trans RT-PCR SuperMix kit购自北京全式金生物技术有限公司。

细胞培养与药物处理 将MCF-7按常规培养在含15%新生牛血清的1640培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养，细胞为贴壁生长，每5～6 d传代，取对数生长期的细胞进行实验。处理前，将MCF-7消化后接种于细胞培养板，待细胞贴壁生长至80%的融合状态，加入10 μmol/L ADM作用12 h和48 h，于预处理组应用10 g/L的LY294002，12 h后加入10 μmol/L 的 ADM 作用48 h。

Western blot检测 p-Akt、Snail、E-cadherin 的表达 将MCF-7消化后接种于6孔板，药物处理后收集各组细胞，加入细胞裂解液，于4℃、12 000×g离心10 min，小心吸出上清液，用Bradford法进行蛋白质定量。经变性后取30 μg蛋白质/泳道进行SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，转移蛋白到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，分别与p-Akt抗体、Snail抗体、E-cadherin抗体杂交过夜，以Akt、β-actin作为对照，TBST洗膜5 min×3次，加入HRP标记的Ⅱ抗，摇床上室温孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，最后用DAB-HRP荧光检测试剂激发荧光，于暗室显影和定影后进行图像分析。

RT-PCR检测Snail、E-cadherin的表达 将MCF-7消化后接种于6孔板，药物处理后收集各组细胞，Trizol试剂提取细胞总RNA，溶于无RNase水中，紫外分光光度计测定D260/D280的比值在1.8～2.0之间。用北京全式金生物技术有限公司逆转录试剂盒提供的25℃ 10 min、42℃ 30 min、85℃ 5 min的条件合成cDNA，再取RT产物于50 μl体系进行PCR循环，并以β-actin做为内参照。反应结束后，取PCR产物5 μl在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，在捷达凝胶成像系统中观察并摄图。Snail上游引物为5'-TCAGACGAGGACAGTGGGAAAG-3'，下游引物为5'-GCTTGTGGAGCAGGGACATTC-3'，产物长度 487 bp。E-cadherin上游引物为5'-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3'，下游引物为5'-GGATGACACAGCGTGAGAGA-3'，产物长度225 bp。β-actin上游引物为5'-AAATCTGGCACCACACCTTC-3'，下游引物为5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，产物长度432 bp。PCR反应条件均为94℃预变性40 s;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，28个循环;最后72℃延伸7 min。

统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，所有实验均重复3次以上，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

LY294002对ADM刺激MCF-7细胞Akt磷酸化的干预作用 ADM处理MCF-7细胞后，Akt磷酸化水平提高 (P＜0.05)，并且此效应随时间延长而更为显著;与ADM直接作用48 h组相比，LY294002处理12 h后再经ADM作用48 h的细胞，Akt磷酸化水平明显降低，差异有统计学意义 (P＜0.05)(图 1)。

LY294002对ADM刺激MCF-7细胞Snail表达的干预作用 与对照组相比，ADM能升高胞内Snail蛋白和mRNA表达量 (P＜0.05)，随时间延长而更为显著。预先采用LY294002处理组与ADM处理48 h组相比，Snail表达明显减少 (P＜0.05)(图2、3)。

LY294002干预ADM对E-cadherin表达的影响

与对照组相比，ADM能降低胞内E-cadherin蛋白和mRNA表达量 (P＜0.05)，随时间延长而更为显著。预先采用LY294002处理组与ADM处理48 h组相比，E-cadherin表达明显增加 (P＜0.05)(图4、5)。

图1 LY294002对ADM刺激MCF-7细胞Akt磷酸化的干预作用Fig 1 Effect of LY294002 on adriamycin-induced phosphorylation of Akt in MCF-7

图2 LY294002对ADM刺激MCF-7细胞Snail蛋白表达的干预作用Fig 2 Effect of LY294002 on adriamycin-induced expression of Snail in MCF-7

图3 LY294002对ADM刺激MCF-7细胞Snail mRNA表达的干预作用Fig 3 Effect of LY294002 on adriamycin-induced mRNA expression of Snail in MCF-7

图4 LY294002干预ADM对E-cadherin蛋白表达的影响Fig 4 Effect of LY294002 on adriamycin-induced expression of E-cadherin in MCF-7

图5 LY294002干预ADM对E-cadherin mRNA表达的影响Fig 5 Effect of LY294002 on adriamycin-induced mRNA expression of E-cadherin in MCF-7

讨 论

化疗药物在有效清除肿瘤细胞的同时，亦会引起肿瘤细胞恶性程度增加［6-7］。作为首个在临床上使用的蒽环类抗癌药、当前乳腺癌治疗最有效的药物之一，ADM在临床应用中常引起肿瘤细胞的化疗耐药与转移而降低疗效，探明其具体机制对改善肿瘤治疗极有意义。

E-cadherin是一种依赖Ca2+的细胞间跨膜黏连糖蛋白分子，主要存在于上皮组织中，参与细胞间的连接。作为EMT的关键分子，E-cadherin的表达下调或抑制和功能丧失都可以启动EMT，肿瘤细胞经过这种细胞表型的转化获得更高的侵袭性［8］。本研究中，以ADM处理乳腺癌细胞MCF-7，12 h后E-cadherin表达开始下调，48 h下降更显著，证明ADM在早期即诱导细胞发生EMT，此结果与相关文献报道基本一致。同时在此过程中，细胞的形态发生变化，迁移能力增强［9］。

进一步结果显示，ADM诱导乳腺癌细胞发生EMT的过程中，伴随Akt磷酸化水平上升，Snail转录因子表达增加，且有显著的时间效应。以PI3K特异性抑制剂LY294002预处理能显著降低Akt磷酸化及活性，减少Snail含量，刺激E-cadherin表达，逆转ADM诱导的EMT。这表明ADM能通过Akt通路上调Snail表达，诱导乳腺癌细胞发生EMT，且随时间延长而效果更显著，而LY294002可逆转此过程。

PI3K/Akt信号转导途径与Snail转录因子参与多种细胞的EMT:如PI3K/Akt信号途径的激活可诱导前列腺癌发生EMT［10］，肝癌的EMT与PI3K通路及Snail的活性上调有关［11-12］，乳腺癌细胞 EMT与Snail高表达有关［13］。本研究表明，PI3K/Akt信号通路及Snail在乳腺癌细胞EMT中有重要地位，且PI3K/Akt信号通路参与了Snail表达调控。

综上，本研究提示了ADM联合LY294002治疗乳腺癌的新思路。肿瘤细胞的化疗耐药与EMT密切相关可能与两者都受PI3K/Akt通路调节有关［14］。早期以LY294002阻止EMT的发生，对防止耐药性形成、降低转移风险有重要意义，能有效抑制应用ADM的不良后果。另外，PI3K/Akt通路已被证实参与肿瘤增殖、耐药、转移、EMT等众多进程［9-10，15-17］。以 PI3K为靶点的治疗方案可能同时阻断多条信号传导通路，起到高效、多向的治疗作用，具有广泛应用前景。

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Effect of LY294002 on Adriamycin-induced Epithelial-mesenchymal Transition in Human Breast Carcinoma Cells

QIAN Yu-jun，CHENG Xiang-ming，WANG Bin，XU Lei，WU Chen-jiang，ZHAO Meng-lin，QI Xiao-hong，GUO Jun

Laboratory Center for Basic Medical Sciences，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

GUO Jun Tel:025-86862882，E-mail:Guoj69@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the effect of LY294002 on the adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition in human breast carcinoma cells.MethodsHuman breast carcinoma cells MCF-7 was culturedin vitroand then exposed to adriamycin with or without LY294002.The protein expression levels of Akt，phosphorylated-Akt(p-Akt)，Snail，and E-cadherin was detected by Western blot analysis.The mRNA expressions of Snail and E-cadherin were determined by RT-PCR.ResultsAdriamycin significantly increased the protein expression of Snail and depressed the protein expression of E-cadherin(P＜0.05).The pre-treatment with LY294002 significantly reversed the changes of activities and levels of the above proteins(P＜0.05).ConclusionLY294002 could reverse the adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition in human breast carcinoma cells by regulating the expressions of Snail and E-cadherin through suppressing PI3K/Akt signaling pathway.

adriamycin;LY294002;human breast carcinoma cells;epithelial-mesenchymal transition

国家自然科学基金 (81170714)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81170714)

郭 军 电话:025-86862882，电子邮件:Guoj69@yahoo.com.cn

R966

A

1000-503X(2012)04-0319-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.04.002

Acta Acad Med Sin，2012，34(4):319-323

2012-02-29)

·综 述·