革兰氏阳性菌和阴性菌对山梨酸钾的耐受差异性

滕 菲， 郭桂萍， 赵 勇， 潘迎捷， 卢 瑛＊

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.江苏南通出入境检验检疫局，江苏 南通 226000）

革兰氏阳性菌和阴性菌对山梨酸钾的耐受差异性

滕 菲1， 郭桂萍2， 赵 勇1， 潘迎捷1， 卢 瑛＊1

（1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.江苏南通出入境检验检疫局，江苏 南通 226000）

对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对山梨酸钾防腐剂的耐受性差异进行了探讨。以食品中常见的革兰氏阳性菌（蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌）与革兰氏阴性菌（沙门氏菌、副溶血弧菌、荧光假单胞菌）为研究对象，针对纯培养状态和模拟食品体系进行了研究。结果显示，加入1 g／L山梨酸钾后革兰氏阴性菌的菌数可减少近102～103.5CFU／m L，而革兰氏阳性菌的菌数只能减少近10 CFU／m L，说明山梨酸钾对革兰氏阴性菌的抑菌效果比革兰氏阳性菌要高2倍以上。最小抑菌浓度实验和即食海带的接种模拟实验结果与生长曲线结果相吻合，显示革兰氏阳性菌对山梨酸钾的耐受性强于革兰氏阴性菌，此结果对于今后应用山梨酸钾进行革兰氏阳性菌类的防控具有重要意义。

革兰氏阳性菌；革兰氏阴性菌；耐受性；山梨酸钾

食源性疾病是发展中国家和发达国家的首要食品安全问题，对人类健康危害严重，尤其是对儿童、孕妇和老人。食品在生产和贮藏过程中，易受细菌性微生物感染而腐败变质，并导致食物中毒和食源性疾病影响人类健康。采用防腐剂抑制腐败菌与食源性致病菌是贮藏食品的有效手段之一［1］。常见的食源性致病菌种类繁多，其中包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。目前水产品中的主要防腐剂有山梨酸钾，山梨酸，二氧化氯水溶液等［2］。山梨酸钾作为一种不饱和脂肪酸，可在体内参与新陈代谢，最终被分解成二氧化碳和水，而几乎没有毒性［3］，目前山梨酸钾已成为一种在全球范围使用广泛的化学防腐剂。

金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌是革兰氏阳性菌，在环境中分布广泛［4－5］，两者在我国水产品中都曾有报道被检出［4，6－7］。副溶血弧菌是一种革兰阴性嗜盐杆菌，主要分布于沿岸海水、海河交界处及海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，在海产品上的带菌率高达45.7%［8］。有报道称这3种菌引起的食物中毒事件近年来呈上升趋势［9］。沙门氏菌是革兰氏阴性无芽抱杆菌，是我国进口水产品致病菌检测中的必检项目［10］。作者选取这4种菌以及食品中常见的蜡样芽孢杆菌和荧光假单胞菌作为实验对象，对纯培养状态和模拟食品体系中的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对山梨酸钾防腐剂的耐受性差异进行了探讨，以期为今后制定更有针对性的食品防控措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料山梨酸钾（食品添加级）：购自珠海市悦发食品有限公司；菌株：购于ATCC；培养基：胰蛋白胨大豆肉汤和胰蛋白胨大豆琼脂（TSB，TSA）：均购于中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司；即食海带（1 k G真空包装）：上海扬骐工贸有限公司所赠。

1.1.2 主要仪器与设备隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司产品；分析天平：梅特洛－托利多公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化及菌悬液制备菌种于－80℃冰箱中取出，取一环接种于5 m L TSB中，活化3次。

1.2.2 生长曲线实验取500μL活化3次后的菌液接种于100 m LTSB的三角烧瓶中，37℃、170 r／min转摇床培养至菌数为103CFU／m L时加入山梨酸钾。于37℃培养箱中培养。加入的山梨酸钾质量浓度为0.2，1，2，4 g／L，另取一组未加山梨酸钾的培养基做为对照组，每个质量浓度做3个平行。持续培养，每小时取样品进行平板记数。

1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）实验参考 Millette等人的试验方法［12］，首先将山梨酸钾溶于TSB中，二倍梯度稀释，取各梯度稀释液0.1 m L注入无菌的96孔培养板中。然后每个孔中加入5×105CFU／mL指示菌，实际实验中山梨酸钾的最终质量浓度为600，300，150，75，37.5，15.75 g／L。另外取一组未接指示菌的山梨酸钾梯度液作为阴性对照。将96孔板盖上无菌膜放于37℃培养24 h。然后于96孔酶标仪600 nm下测定吸光值。样品孔指示菌的A600值与阴性对照组有明显差异时的浓度视为最小抑菌浓度。

1.2.4 接种海带实验取新鲜出厂的真空包装即食海带样品，用体积分数95%乙醇浸泡30 min，无菌水洗3次备用，此时海带的带菌量小于5 CFU／mL，吸取103CFU／mL活化3次后的各菌液分别滴加到盛有25 g酒精处理后海带的无菌培养皿中，置于37℃恒温培养箱中培养。参考食品添加标准GB2760－1996系列中针对即食海带的规定［11］，加入1 g／L山梨酸钾溶液；另取一组未加山梨酸钾的酒精处理后海带做为对照组，每个质量浓度做3个平行。持续培养24 h，每4 h取样品进行平板记数。

2 结果与分析

2.1 生长曲线结果

由图1可见，蜡样芽孢杆菌组中加入山梨酸钾后，在进入生长平衡期时（8 h），加入1 g／L山梨酸钾时菌数比对照组减少了近10 CFU／m L，加入2，4 g／L山梨酸钾时比对照组减少了近100 CFU／m L。对于金黄色葡萄球菌组，在培养4 h后可观察到较明显变化：加入1，2 g／L山梨酸钾组其菌数比对照组减少了近100.5CFU／m L，加入4 g／L山梨酸钾时菌数比对照组减少了约10 CFU／m L。对于单增李斯特菌组，培养20 h后，加入了1、2 g／L山梨酸钾组的菌数比对照组减少了近10 CFU／m L，而加入了4 g／L山梨酸钾组的菌数则比对照组减少了近100 CFU／m L。国标中规定的山梨酸钾最大加入量为1 g／L，上述3种菌在此浓度时的菌数与对照组相比，都减少了约10 CFU／m L。上述结果显示，山梨酸钾对蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌有一定的抑制作用。

图1 致病菌在不同山梨酸钾质量浓度下的生长曲线图Fig.1 Effect of potassium sorbate concentration on the growth curves of three gram positive bacteria

图2 致病菌在不同山梨酸钾质量浓度下的生长曲线图Fig.2 Effect of potassium sorbate concentration on the growth curves of three gram negative bacteria

由图2可知，沙门氏菌组中加入了1 g／L山梨酸钾后生长平衡期（10 h）的菌数比对照组减少了100 CFU／m L，加入4 g／L山梨酸钾组则减少了将近103.5CFU／m L。副溶血弧菌组在培养6 h后，加入0.2 g／L山梨酸钾后即比对照组减少了近101.5CFU／m L，加入1 g／L 山梨酸钾后减少了近103.5CFU／m L，加入4 g／L山梨酸钾后的菌数比对照组减少了近104CFU／m L。对于荧光假单胞菌，加入0.2 g／L山梨酸钾后在生长平衡期（10 h）的菌数比对照组减少了近10 CFU／m L，加入1 g／L山梨酸钾后减少了近100 CFU／m L，加入了4 g／L山梨酸钾后的平台期菌数比对照组减少了近103CFU／m L。综上所述，上述3种菌在加入了国标所规定的最大质量浓度1 g／L山梨酸钾时，与对照组相比，平台期的菌数减少了102～103.5CFU／m L。由此可见，山梨酸钾对沙门氏菌、副溶血弧菌、荧光假单胞菌3种菌的抑制作用较强。

2.2 最小抑菌浓度（MIC）实验结果

由表1可见，山梨酸钾对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的最小抑菌浓度最高，达到600 g／L，对单增李斯特次之，为300 g／L，对荧光假单胞最低，仅为37.5 g／L，对副溶血弧菌次之，为75 g／L。虽然山梨酸钾对沙门氏菌的最小抑菌浓度与单增李斯特菌相同，但山梨酸钾对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度（300 g／L）整体高于革兰氏阴性菌 （150 g／L）。这与前面的生长曲线结果相吻合。

表1 山梨酸钾对革兰氏阳性菌和阴性菌的抑菌效果Tab.1 Effects of potassium sorbate concentration of growth of gram positive and negative bacteria

2.3 即食海带接种实验结果

由图3可知，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌接种到即食海带中后，山梨酸钾组的生长曲线与对照组基本重合，并同时达到生长平衡期。上述结果说明1 g／L山梨酸钾对这两种革兰氏阳性菌的生长基本上没有抑制作用。

图3 即食海带中革兰氏阳性菌的生长曲线图Fig.3 Growth curves of two gram positive bacteria inoculated to instant kelp

由图4可知，沙门氏菌和副溶血性弧菌接种到即食海带中后，在生长平衡期（16～20 h），这两种菌的山梨酸钾加入组的菌数比对照组减少了近10 CFU／m L，结果显示1 g／L山梨酸钾对沙门氏菌和副溶血性弧菌有一定的抑制作用。

图4 即食海带中革兰氏阴性菌的生长曲线图Fig.4 Growth curves of two gram positive bacteria inoculated to instant kelp

3 结语

选用了3种革兰氏阳性菌（分别为蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌）和3种革兰氏阴性菌（分别为沙门氏菌，副溶血弧菌和荧光假单胞菌），探讨了食品工业中常用的防腐剂山梨酸钾对这些菌的抑菌效果。不同山梨酸钾质量浓度下的生长曲线结果显示，加入1 g／L山梨酸钾后，革兰氏阴性菌的菌数可减少近102～103.5CFU／m L，而革兰氏阳性菌的菌数只能减少近10 CFU／m L，即山梨酸钾对革兰氏阴性菌的抑菌效果比革兰氏阳性菌要高2倍以上。最小抑菌浓度结果和即食海带的接种模拟实验结果也显示出革兰氏阳性菌对山梨酸钾的耐受性要高于革兰氏阴性菌，与生长曲线结果相吻合。研究显示，山梨酸钾需要通过微生物细胞膜进入细胞内，造成胞内p H值降低而抑制细胞的基本代谢反应。山梨酸钾具有亲脂性［14］，革兰氏阴性菌的细胞壁脂类物质含量较高，因此山梨酸钾分子易通过；革兰氏阳性菌的细胞壁则含有大量肽聚糖，不易通过。因此，作者认为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁的结构差异可能是造成两者对山梨酸钾耐受性差异的主要原因。

山梨酸钾在食品工业中作为防腐剂应用范围十分广泛，在很多食品中的使用质量浓度不得超过1 g／L，研究显示，蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌这些革兰氏阳性菌在37℃时对高于此规定质量浓度的山梨酸钾仍有一定的耐受性，具有较好的生长趋势。这说明即便是添加了山梨酸钾防腐剂，一旦在食品供应销售过程中其贮藏或保存条件不当时，这些菌还是具备大量繁殖能力，即还存在着食品安全的隐患。因此，在应用山梨酸钾防腐剂时，对于革兰氏阳性菌类应予以特殊重视并多管齐下进行控制为宜。

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Study of the Tolerance Difference between Gram Positive and Gram Negative Bacteria to Potassium Sorbate

TENG Fei1，GUO Gui－ping2，ZHAO Yong1，PAN Ying－jie1，LU Ying＊1

（1.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Nantong Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nantong 226000，China）

In this study，the tolerance of 3 gram positive（Bacillus cereus，Staphylococcus aureusandListeria monocytologene）and 3 gram negative bacteria（Vibrio parahaemolyticus，SalmonellaandPseudomonas fluorescens）topotassium sorbate were carefully studied by pure cultivation and simulation of food system.When 1 g／L potassium sorbate was presented in culture，the number of gram negative bacteria was reduced to up to 2～3.5 lg（CFU／m L），while those of gram positive bacteria were only reduce to 1 lg（CFU／m L）.This results demonstrated potassium sorbate inhibited on the gram negative bacteria growth than that of the gram negative bacteria.Results of pure culture，minimal inhibitory concentration（MIC）and inoculation to instant kelp results all showed that the tolerance of gram positive bacteria is better than gram negative bacteria.It may have significance in the application of potassium sorbate on the control of gram positive bacteria.

gram positive，gram negative，tolerance，potassium sorbate，innoculation

＊

卢瑛（1971－），女，浙江东阳人，理学博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事食品生物技术方面的研究。Email：y－lu＠shou.edu.cn

TS 201.6

A

1673－1689（2012）04－0417－06

2010－12－21

上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2009）第6－1号）；上海市教育委员会科研创新项目（09YZ274）；江苏出入境检验检疫局科研项目（2010KJ34）；上海市教育委员会重点学科建设项目（J50704）。