TLR4在HPV感染相关的宫颈病变发展中的作用

诸葛静

Toll样受体 4(toll -like receptor,TLR4)是脂多糖的天然受体,在调节急性炎症反应、 细胞信号转导和细胞凋亡中起重要作用。炎症性组织中都可以检测到TLR4的表达，且不管在病毒感染性疾病组织还是在细菌感染造成的炎症疾病组织中都可见TLR4表达增高[1,2],提示TLR4介导的天然免疫反应是炎症性疾病发生的起点，同时TLR4介导细菌感染性免疫反应也可能参与了病毒性炎性病变的发生，具体机制并不清楚。我们通过研究TLR4在HPV感染导致的宫颈疾病中的表达，研究其与HPV感染的相关的疾病间的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

研究对象选自妇科门诊及普查中采用TCT发现的可疑者，再行阴道镜行宫颈多点活检病理检查，诊断为宫颈炎合并HPV感染、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期和宫颈癌的患者。阴道镜检测同时，取宫颈脱落细胞进行杂交捕获(Hybridization Capture)HPV DNA分析，确定HPV16感染才记入,所有患者均为新发患者。每亚组选择20例，同时使用健康的宫颈组织(如因子宫肌瘤、宫血等切除子宫)20例作为对照组。

1.2 方法

将新鲜组织放在液氮中保存，实验前研磨成粉末后，取0.5 g匀浆研碎组织裂解后提取总RNA，纯度A260/A280在1.8～2.2之间，逆转录后再PCR扩增，产物凝胶电泳后置凝胶成像系统分析。内对照β-actin的mRNA分别与TLR4和HPV16 E7的mRNA在同一体系共同扩增，以降低干扰因素对实验结果的影响。凝胶在图像系统上分析出所有mRNA的密度后，将β-actin的密度作为内对照，目的基因与内对照的密度之比为目的基因表达的相对值。每组实验重复3次，取平均值。TLR4上游引物5'-AATCTAGAGCACTTGGACCTTTCC，下游引物3'-GGGTTCAGGGACAGGTCTAAAGA；E7上游引物5'-ATGAGCAATTACCCGACAGC，下游引物3'-AGCCCATTAACAGCTCTTGC；β-actin上游引物5'-AAGAGAGGCATCCTCACCCT,下游引物3'-TACATGGCTGGGGTGTTGAA。

1.3 统计学方法

所有的数据都输入SPSS13.0软件，组间比较采用方差分析，同时采用了线性相关分析法。

2 结果

2.1 TLR4的RNA含量的变化

RT-PCR结果显示，从正常宫颈组织，到感染HPV16的宫颈炎性组织，再到CIN组织，最后到宫颈癌组织，TLR4的表达逐渐增加，对照组显著减少(图1)。经灰度值分析，各组的TLR4表达值见表1 ，组间差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 HPV16 E7 的RNA含量的变化

HPV16 E7在各组中RNA的含量经灰度值分析，从正常宫颈到宫颈炎性组织再到宫颈癌，HPV16 E7的表达有上升趋势，但差异经统计学分析无显著意义(表1、图2)。

表1 TLR4和HPV16 E7基因在各组宫颈组织中的表达比较

图1 TLR4基因在各组宫颈组织中的表达

图2 HPV16 E7基因在各组宫颈组织中的表达

2.3 TLR4和HPV16 E7表达含量的相关性分析

对宫颈癌组织中的TLR4和HPV16 E7的基因含量进行双因素相关分析，结果为γ=0.121，经对相关系数的假设检验，P=0.0612,统计学上无明显意义，说明两者不存在明显相关性。

3 讨论

宫颈癌是迄今人类所有癌症中唯一明确病因的癌症。几乎所有宫颈癌患者的宫颈组织中，均可以找到高危型人乳头瘤病毒存在。流行病学调查和实验室研究数据均显示，人乳头瘤病毒感染是子宫颈癌的主要流行因素，特别是HPV16型高危病毒[3,4]。人体感染HPV后，病毒基因E7或E6可整合到宫颈的上皮细胞内，可能发生2种转归：对于机体免疫功能正常的人群来讲，感染的期限比较短暂，通常8～10个月会通过自身免疫系统将病毒清除掉，也就是“一过性感染”。另一种结局是，机体免疫系统无力将其清除，致使感染持续存在，进而引起宫颈细胞的增生、异型性变，最终发生癌变[5]。那么，机体在识别HPV16感染过程时必然会激活天然免疫防疫系统。

宫颈癌也经历了宫颈炎性反应过程，这种天然的免疫炎性反应多有TLRs通路介导，一方面宫颈上皮尽可能识别感染的HPV病毒并将其清除，另一方面，参与反应的许多炎症趋化因子又可以促进宫颈上皮不典型增生，最终甚至癌变。研究表明TLR4在许多皮肤黏膜表面表达，通过识别病原微生物激活天然免疫防疫反应，调控致炎因子的释放，在皮肤及黏膜的免疫反应中发挥重要的作用[6]。同时，TLR4介导的炎症反应是许多重要疾病的公共通路。

丝裂原活化的蛋白激酶(P44/42MAPK)途径的活化广泛地受增殖和炎症信号调控[7]；在单核细胞和巨噬细胞中，细菌的脂多糖(LPS)通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)诱导P44/42的活化，激活NFkB，调控机体的炎症信号通路。而识别细菌LPS的模式识别受体Toll-like receptor 4(TLR4)在很多疾病中都有高表达，其调控的信号通路不仅可以激发机体的先天免疫[8]，同时对后续的继发免疫反应发生发展具有一定的作用。

我们的研究发现，TLR4在HPV感染后的宫颈病变中随着病变严重程度增加，表达上升，差异有显著性(F=16.23，P=0.0041)，说明TLR4在宫颈中的表达与宫颈癌的发生发展有关。而HPV16是宫颈癌的确定致病因素，但其在宫颈病变中的表达虽随病变严重程度有升高趋势，但差异无显著性(F=2.13，P=0.0526)，说明HPV16触动了宫颈病变的发生，但宫颈病变的发展与HPV的负荷量不一定相关。相关分析的结果表明，TLR4在宫颈癌中的表达与HPV无关(γ=0.121，P=0.0612)，这暗示TLR4信号通路可能不是介导HPV感染后机体的天然免疫防疫反应路径。

toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是感知外源性微生物刺激的“哨兵”，TLRs广泛存在于天然免疫细胞膜上，与其配体结合在微生物感染或组织损伤引起的天然免疫和适应性免疫应答中起决定性作用。TLRs在正常情况下绝大部分表达在抗原提呈细胞表面，如吞噬细胞(包括巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞)表面。TLR家族中至少有13种成员，迄今为止，发现人类存在11种TLR成员( TLRl-11)。一般而言，TLR3、7、8和9表达在细胞质内，可以识别入侵的病毒，而TLR4则识别入侵的细菌等[9]。

因此，结合我们的研究发现TLR4在HPV相关的宫颈病变中高表达，且与HPV16无关，说明，HPV16虽然是触动宫颈病变发生发展的主因，但宫颈癌的发生可能还有其他病原体感染的参与。这些病原体激活了TLR4信号通路，触发了炎症反应信号系统，加速了宫颈病变。

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[2]Raicevic G,Najar M,Pieters K,et al.Inflammation and TLR ligation differentially affect the osteogenic potential of human mesenchymal stromal cells (MSC) depending on their tissue origin.〔J〕.Tissue Eng Part A,2012,25.

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