DNA 甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞株CNE2的影响

莫正英 王凤琴 梁清乐

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方地区常见的1种恶性肿瘤，发病率和死亡率均居世界首位，严重威胁我国人民的身体健康和生命。尽管人们一直在探索鼻咽癌的发病机制，但鼻咽癌的发病机制还不清楚。大量的研究表明[1～3]，肿瘤的发生发展是多基因参与、多阶段的病理过程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生与发展的重要原因，而启动子区DNA甲基化又是抑癌基因失活的重要机制之一。抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等[4]，尤其是抑癌基因启动子区CpG岛过甲基化是肿瘤发生的重要环节之一。DNA甲基化(DNA methylation)修饰是基因表达调控的重要表观遗传学机制之一，它通过延迟DNA复制、抑制转录起始、改变染色质的物理或化学结构使基因转录沉默(silencing)，导致基因功能失活[5]。5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2dC)是1种DNA甲基转移酶1(DNMT 1)的抑制剂，很多体外研究证实，5-aza-2dC通过去甲基化作用使多种CpG岛过甲基化的抑癌基因重新表达，而恢复抑癌功能[6，7]。但5-aza-2dC对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2的作用少见报道。为探讨DNA 甲基转移酶抑制剂5-aza-2dC对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2的影响，本研究以CNE2细胞株为样本，用不同浓度5-aza-2dC处理CNE2细胞，使它的甲基化沉默基因重新表达，检测其对CNE2的影响，为临床治疗提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

人低分化鼻咽癌细胞株CNE2购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。奈达铂(nedaplatin,NDP)(江苏奥赛康药业有限公司产品)；5-aza-2dC(美国Sigma公司)，RPMI 1640培养液(美国GIBCO公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(Amresco公司)，二甲亚砜(DMSO,SIGMA公 司)，酶联免疫检测仪(BIO-RAD550，美国伯乐公司)，流式细胞仪(美国Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制 5-aza-2dC用含10% 小牛血清的RPMI 培养液溶解，配成浓度为10-3mol/L的储存液，-20℃保存，使用时用RPMI 培养液稀释为工作液。MTT溶于PBS中，过滤除菌，浓度为5 mg/ml，避光冷藏。

1.2.2 细胞培养 CNE2细胞在RPMI 1640完全培养基中培养(10%小牛血清)，于37℃、5% CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%胰酶消化，用4 g/L苔盼蓝染色后计算细胞存活率，细胞存活率达99%时进行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1×105/ml备用。

1.2.3 5-aza-2dC处理鼻咽癌细胞 CNE2细胞以104/ml密度接种到96孔培养板中，细胞贴壁后换含5-aza-2dC新鲜培养液，每24 h更换含有5-aza-2dC的培养液，对照组CNE2细胞用不含5-aza-2dC的培养液同时培养。

1.3 MTT比色法检测5-aza-2dC对鼻咽癌细胞生长的影响

96孔板接种细胞，每孔104个，每孔均加入200 μl含10% 小牛血清RPMI 1640完全培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养,24 h细胞完全贴壁后吸出每个孔的培养液，分别加入10-7、10-6、10-5、10-4mol/L浓度的5-aza-2dC处理，以不加药物为阴性对照组，以奈达铂(1 μg/ml)处理为阳性对照组，每孔中体积为200 μl。每组3个重复。培养0、12、24、36、48、72 h，按照培养的不同时间点收集细胞。实验终止前4 h加入MTT液20 μl/孔，实验结束后吸取培养液，每空加入150 μl DMSO,平板震荡10 min，应用酶联免疫检测仪，于490 nm波长处测定各孔吸光度OD值，然后绘制细胞生长曲线。

1.4 流式细胞术检测5-aza-2dC对鼻咽癌细胞凋亡的影响

CNE2细胞处理同1.2.3，5-aza-2dC处理 72 h后，收集细胞，制成单细胞悬液，2 000 r/min离心5 min，弃去上清，PBS洗3次；70%预冷的乙醇、4℃固定2 h，调整细胞浓度为106个/ml，应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 甲基化特异性PCR检测DAPK 启动子区甲基化状态

DARK基因甲基化引物。甲基化引物，上游 5′-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3′；下游 5′-CCCT-CCCAAACGCCGA-3'； 片段长度98 bp。非甲基化引物，上游 5′-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3′；下游 5′-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3′；片段长度108 bp。 以β-actin为内参，逆转录后行目的基因和β-actin cDNA扩增。分别取逆转录产物2.5 μl用于PCR检测。 50 μl 体系包括：10×PCR buffer 5 μl ，2.5 mmol/L dNTP mix 4 μl ，上、下游引物各20 pmol，Taq DNA polymerase 0.4 μl ，模板cDNA 2.5 μl,灭菌水36.1 μl。VEGF PCR 条件：94℃预变性3 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 1 min,30次循环，72℃延伸10 min。取PCR 产物置于2%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，电泳条带经电泳图像分析仪照相。

1.6 统计学处理

所有资料均应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT检测细胞增殖

不同浓度5-aza-2dC处理CNE2细胞0、6、12、24、48、72 h后，MTT比色法检测细胞增殖，结果显示随着抑制剂浓度的增加和处理时间的延长，其抑制CNE2细胞增殖作用增强，统计结果显示同一作用时间下不同药物浓度组间，细胞生存率差异有统计学意义(P<0.05),10-4mol/L 5-aza-2dC处理CNE2细胞72 h，对细胞增殖抑制作用最明显(P<0.05)，见图1。

图1 不同浓度5-aza-2dC处理CNE2细胞的增殖曲线

2.2 流式细胞术检测5-aza-2dC对鼻咽癌细胞凋亡的影响

不同浓度5-aza-2dC处理CNE2细胞72 h后，应用流式细胞仪检测细胞凋亡，发现10-4mol/L 5-aza-2dC诱导细胞凋亡最明显(P<0.01)(表1)。结合MTT结果，发现10-4mol/L 5-aza-2dC处理CNE2细胞72 h细胞凋亡最明显。

表1 不同浓度5-aza-2dC对鼻咽癌细胞凋亡的影响

注 *为与对照组比较,P<0.01

2.3 5-aza-2dC对CNE2细胞DAPK启动子甲基化状态的影响

MSP法检测CNE2细胞DAPK启动子甲基化状态的结果显示：甲基化引物的扩增条带为阳性，非甲基化引物扩增条带为阴性。5-aza-2dC作用后，CNE2细胞甲基化引物扩增条带为阴性，非甲基化引物扩增条带为阳性，见图2。

图2 5-aza-2dC处理前后CNE2细胞DAPK启动子甲基化状态

3 讨论

鼻咽癌是1种极具特色的肿瘤，有着奇特的分布和复杂的病因学。在鼻咽癌的发生发展中，癌基因激活或过度表达并不是一个主要因素。在鼻咽癌中，经典的癌基因如ras基因及mdm2基因的突变在鼻咽癌中并不多见，相反，在鼻咽癌的演进过程中，肿瘤抑制基因的失活却更为普遍，且发挥更重要的作用。研究发现鼻咽癌中存在多个肿瘤抑制基因的失活。而近年来研究发现，许多肿瘤抑制基因在鼻咽癌中因甲基化而失活，相对于突变及基因缺失，鼻咽癌中肿瘤抑制基因的表观遗传学改变为更普遍[8]。启动子区CpG 岛高甲基化是肿瘤抑制基因失活的基本机制[9]。在鼻咽癌中肿瘤相关基因的甲基化改变参与了包括细胞周期调控、DNA 修复、细胞凋亡及肿瘤浸润转移的全过程。DNA过甲基化是引起抑癌基因失活的重要方式，DNA过甲基化并不是基因序列发生改变，而只是部分碱基对发生甲基化修饰，这种异常的甲基化模式是可以逆转的[10]。5-aza-2dC是DNMT1的抑制剂，在DNA复制过程中与DNA分子相结合，并与DNMT1形成一共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，生成低甲基化子链，从而实现去甲基化功能，恢复多个抑癌基因的表达。5-aza-2dC可使多种因甲基化而失活的抑癌基因重新表达，并且可以诱导凋亡，体外实验证明其可抑制多种肿瘤细胞的生长[11，12]。 本研究显示人低分化鼻咽癌细胞株CNE2经过5-aza-2dC处理后，细胞状态发生明显改变，经MTT法检测的细胞生长曲线可以看出细胞增殖受到不同程度的抑制。说明5-aza-2dC可以抑制人低分化鼻咽癌细胞株CNE2的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，并且抑制作用呈浓度依赖性，随着浓度增大其抑制作用也越强。在48～72 h内，同一浓度5-aza-2dC随着作用时间的延长，其抑制作用也增强，在10-4mol/L作用72 h时抑制作用最强。流式细胞仪检测也显示出细胞凋亡与5-aza-2dC的作用浓度呈依赖性，在10-4mol/L浓度下作用72 h后，细胞凋亡数最多，流式细胞仪检测结果和MTT检测结果都说明5-aza-2dC在10-4mol/L浓度下，处理人低分化鼻咽癌细胞株CNE2能产生明显的生物学效应，能抑制肿瘤细胞增殖。

MSP技术分别检测5-aza-2dC处理前后DAPK启动子的甲基化状态，发现处理前CNE2细胞中DAPK启动子区为高甲基化状态，而处理后的CNE2细胞中DAPK启动子区恢复非甲基化状态，其机制可能是使因甲基化而失活的抑癌基因重新激活而诱导肿瘤细胞的凋亡。本结果说明，5-aza-2dC在体外可能是通过将人低分化鼻咽癌细胞株CNE2中因甲基化而失活的某些抑癌基因去甲基化而重新表达，从而恢复其抑制肿瘤生长的功能，并且诱导肿瘤细胞凋亡，进而抑制了人低分化鼻咽癌细胞株CNE2的生长。

综上，5-aza-2dC在体外可以抑制人低分化鼻咽癌细胞株CNE2增殖，其作为1种甲基化转移酶抑制剂，可以激活人低分化鼻咽癌细胞株CNE2中因甲基化而失活的某些抑癌基因，从而恢复抑制肿瘤生长的功能，引起细胞凋亡，为临床治疗用药提供了一个新的思路，为以后5-aza-2dC在鼻咽癌中的研究提供科学依据。

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