Pokemon和P14ARF蛋白在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

陈 军 覃思繁 林思彤 韦常宏

Pokemon基因即POK红系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid ontogenic factor)是2005年被确定的1种原癌基因[1]，其蛋白产物不仅可以使癌细胞获得抗老化和抗死亡的能力，还能调控其他癌基因或抑癌基因的活性。Pokemon过表达导致ARF降低，通过MDM2使p53突变增加，最终导致肿瘤的发生，因此Pokemon被认为是肿瘤的总开关[2]。本研究检查原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma HCC)组织及相应癌旁组织中Pokemon和P14ARF蛋白的表达情况，以了解它们在人原发性肝细胞癌中的表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

60例肝癌组织，取自广西医科大学附属肿瘤医院2008年8月～2009年8月肝癌患者手术切除的标本，经术后病理诊断为肝细胞癌。60例中男性42例，女性18例，年龄22～65岁，平均年龄(42.3±12.1)岁，中位年龄46岁。所有患者术前均未行任何治疗。按UICC 2002年TNM分期，根据按Edmondeon 病理分级标准进行组织学分级。每例均取癌及对应癌旁肝组织(距肿瘤边缘2 cm)。

1.2 方法

免疫组织化学检查采用Envision两步法。Pokemon浓缩型兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司，抗体稀释浓度为1∶100。P14ARF兔抗人多克隆抗体购自福州迈新生物技术科技公司，抗体稀释浓度为1∶100。即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒购自福州迈新生物技术科技公司。整个过程按试剂盒说明书进行。每批染色均设已知阳性切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液(phosphatic buffered saline，PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判断

Pokemon及P14ARF表达产物主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒为阳性细胞。由2位医师采用双盲法观察每张切片。阳性判断根据染色程度和免疫阳性细胞占肿瘤细胞总数百分比综合记分。按切片中癌细胞染色强度计分：0分细胞无显色；1分呈淡黄色；2分呈棕黄色；3分呈棕褐色(染色深浅需与背景着色相对比)；再按切片中阳性癌细胞数所占的百分比打分：0分为阴性，1分为阳性癌细胞占比≤10%；2分为11%～50%，3分为50%～75%，4分为75%以上。染色强度与阳性细胞百分比的乘积>3分才算免疫反应阳性。

1.4 统计学处理

统计学处理采用SPSS11.0软件进行χ2检验，Spearman相关性分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织及癌旁组织中Pokemon和P14ARF蛋白的表达

肝癌组织及癌旁组织中Pokemon表达阳性率分别为65.0%(39/60)和31.7%(19/60)，2组间比较差异有统计学意义(χ2=13.348，P=0.000)；P14ARF表达阳性率分别为63.3%(38/60)和91.7%(55/60)，2组间差异有统计学意义(χ2=13.811，P=0.000)。

2.2 Pokemon和P14ARF蛋白表达与肝癌临床病理特征的关系

通过比较Pokemon和P14ARF蛋白表达与临床病理特征之间的关系发现，Pokemon蛋白表达阳性与临床分期、肿瘤直径、肿瘤分化程度有关(P<0.05)，与脉管癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤个数及血清AFP等无关(P>0.05)；P14ARF蛋白表达在肿瘤分化程度组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，与临床分期、脉管癌栓、术后复发、肝外转移、肿瘤直径、肿瘤个数及血清AFP等无关(P>0.05)(表1)。

表1 肝癌组织中Pokemon和P14ARF蛋白表达与其临床病理特征的关系(例)

2.3 Pokemon和P14ARF蛋白在肝癌组织中表达的相关性

21例Pokemon表达阴性的标本中有17例P14ARF蛋白表达阳性(81.0%)，38例P14ARF表达阳性的标本中17例Pokemon表达阴性(44.7%)，经Spearman相关性分析，Pokemon和P14ARF蛋白表达在肝癌组织中表达呈显著负相关(γ=-0.268，P=0.038)(表2)。

表2 肝癌组织中Pokemon和P14ARF蛋白表达的关系(例)

3 讨论

Pokemon基因即POK红系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid ontogenic factor)，定位于19p13.3，具有2个外显子和2个内含子，属于POK家族。POK蛋白在胚胎发育、分化和肿瘤形成中有重要作用[3]。近年来越来越多的临床研究显示了Pokemon在肿瘤发生中的作用。Apostolopoulou等[4]在研究非小细胞肺癌中发现pokemon高表达，推测其可能在非小细胞肺癌的发生过程中具有重要作用。付朝江等[5]在乳腺癌的研究中发现Pokemon mRNA在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁乳腺组织及乳腺增生组织，其表达与淋巴结转移、组织学分级相关。我们的研究亦得到类似的结果，Pokemon在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且与临床分期、肿瘤直径、肿瘤分化程度密切相关，提示其在肝细胞癌的发生与进展中可能起着重要作用。

研究发现细胞周期调控的G1途径异常起了重要作用。G1途径包括：由P16INK4A-CyclinD1-CD4/6-pRb-E2F组成的Rb通路(P16-Rb)和P14ARF-MDM2-p53组成的p53通路(P14ARF-p53)，各因子互相影响，形成复杂的调控机制[6]。P14ARF-p53通路是细胞周期调控网络中的重要一环，对肿瘤的发生发展及预后起着重要作用[7]。研究已发现P14ARF在胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤中表达均下调。本研究表明60例人肝细胞癌肿瘤标本中22例P14ARF缺失，而在癌旁组织中仅缺失5例，显示了在肝细胞癌中P14ARF表达明显下调的现象，这与文献报道的基本一致。进一步分析P14ARF蛋白表达与临床病理参数的关系，高分化肝细胞癌(Ⅰ～Ⅱ级)患者的P14ARF蛋白的缺失率(19.2%)明显低于低分化肝细胞癌(Ⅲ～Ⅳ级)患者的缺失率(50.0%)，这提示P14ARF表达缺失与肝细胞癌的发生发展有一定的相关性，提示P14ARF基因失活可能是肝细胞癌恶性演变的重要因素。Pokemon基因作为1种转录抑制因子可影响多种肿瘤相关因子的转录，研究发现Pokemon强效抑制在细胞周期阻滞中起重要作用的肿瘤抑制因子Rb基因的转录[8]。Maeda等[2]运用荧光素酶标记处理ARF激动剂，观察标记物的活性，发现Pokemon通过剂量依赖模式有效地抑制了P19ARF和P14ARF,同时确定了这种抑制活性的作用需要POZ/BTB域和锌指结构,证明Pokemon是ARF的特异性抑制剂，推测Pokemon通过P14ARF-MDM2-p53通路发挥致癌作用。Choi等[9]最新的研究认为Pokemon作为ARF-Hdm2(人类中与鼠Mdm2同源蛋白)-p53-p21通路的主要控制因素，通过阻断或限制ARF到Hdm2的表达，从而调节p53的表达最终影响到p21的表达。故从理论上推测，Pokemon应该作为上游关键基因对P14ARF有负调节作用。我们的研究分析显示两者间存在弱的负相关关系(γ=-0.268，P=0.038),提示Pokemon和P14ARF之间可能不是仅存在单一的线性关系，可能有更多的基因参与了彼此的调节。

总之，肝癌的发生及发展是1个十分复杂的过程，Pokemon基因高表达及P14ARF基因的表达缺失在其中起着十分重要的作用。相信通过进一步研究Pokemon和P14ARF基因在肝细胞癌中的状态以及它们之间的联系，将为肝细胞癌的分子机制和基因治疗提供十分有用的帮助。

[1]Maeda T,Hobbs RM,Pandolfi PP.The transcription factor Pokemon：a new key player in cancer pathogenesis〔J〕.Cancer Res,2005,65 (19) ：8575.

[2]Maeda T,Hobbs RS,Merghoub T,et al.Role of the proto-oncogene Pokemon in cellular transformation and ARF repression 〔J〕.Nature,2005,433 (7023):278.

[3]He X,Dave VP,Zhang Y,et al.The zinc finger transcription factor Th-POK regulates CD4 versus CD8 T-cell lineage commitment 〔J〕.Nature,2005,433(7028):826.

[4]Apostolopoulou K,Pateras IS,Evangelou K,et al.Gene amp-lification is a relatively frequent event leading to ZBTB7A(Pokemon) overexpression in non-small cell lung cancer〔J〕.J Pathol,2007,213(3):294.

[5]付朝江，崔 明，徐 衍，等.Pokemon mRNA在乳腺癌中的表达及与c-myc相关性分析〔J〕.现代肿瘤医学，2011,19(1)：33.

[6]Michalides RJ.Cell cycle regulators：mechanisms and their role in aetiology,prognosis and treatment of caner〔J〕.J Clin Pathol,1999,52(8):555.

[7]Bracken A P,Kleine-Kohlbrecher D,Dietrich N,et al.The polycomb group proteins bind throughout the INK4A-ARF locus and are disassociated in senescent cells 〔J〕.Genes Dev,2007,21(5):525.

[8]Jeon BN,Yoo JY,Choi WI,et al.Proto-oncogene FBI-1(Po-kemon/ZBTB7A) represses transcription of the tumor suppressor Rb gene via binding competition with Sp1 and recruitment of co-repressors〔J〕.J Biol Chem,2008,283(48)：33199.

[9]Choi WI,Jeon BN,Yun CO,et al.Proto-oncogene FBI-1 represses transcription of P21CIP1 by inhibition of transcription activation by P53 and Sp1〔J〕.J Biol Chem,2009,284(19)：12633.