鼻咽癌组织中上皮-间叶转换的检测及与其转移的相关性

罗爱华 高 嵋 谢 乐 黄卓雅 李飞虹 蔡琼珍 姜汉国

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)在全世界内流行，特别是中国南方如广东、广西、香港多见，与EB病毒感染密切相关[1,2]，大约60%的患者是在颈部淋巴结发生转移后，因颈部肿物而就诊，经临床穿刺或活检证实后已属晚期。放疗和化疗的联合应用是NPC的常规治疗方法，虽然部分患者对放疗敏感，但仍约有40%～60%的鼻咽癌患者因远处转移、局部复发及放化疗副作用等原因导致死亡，其中最为重要的是NPC的远处转移。因此，研究其转移的机制一直是鼻咽癌基础和临床上一个非常重要的课题之一。

虽然目前恶性肿瘤的浸润和转移机制仍不完全清楚，但得到共识的是恶性肿瘤的浸润和转移包括多个步骤和环节[3]。近年来，一些研究提示肿瘤的上皮-间叶转换(EMT)与一些肿瘤的转移密切相关[4～7]。为观察是否鼻咽癌具有EMT样作用及其与转移的关系，我们应用免疫组化法，检测130例鼻咽未分化型非角化性癌中Vimentin和E-cadherin(E-cd)的表达，旨在探讨它们与鼻咽癌转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 收集广东医学院附属医院和附属高州人民医院2004年～2007年收治的鼻咽癌患者130例，其中男性76例，女性54例，中位年龄47岁，检测前未经过任何放疗和化疗，按WHO分类均为未分化型非角化性癌，其中53例经活检、细胞学穿刺和免疫组化检查证实颈部淋巴结已发生转移，内有23例为配对淋巴结鼻咽癌转移，其余77例病理检查确诊鼻咽癌时影像学检查未发现局部浸润、转移性病变和肿大的淋巴结。

1.1.2 试剂及抗体 鼠抗人Vimentin和E-cadherin单克隆抗体及免疫组织化学试剂盒均购于北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常规HE染色，鼻咽癌分别按WHO分型及有无淋巴结转移进行分组。

1.2.2 免疫组织化学染色 免疫组化按SP试剂盒说明书进行操作。由试剂公司提供的阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为空白对照。

1.3 结果判断

Vimentin 阳性表达均定位于细胞质，E-cadherin阳性表达定位于细胞膜，阳性表达均呈棕黄色或棕褐色颗粒样分布。由两人分别独立对实验结果进行双盲法评估。每一切片随机选择5个视野(×100)，在显微镜(×400)下计数每个视野100个肿瘤细胞中阳性细胞比例，非癌组织则计数着色区100个细胞中阳性细胞比例，取5个视野的平均百分数为判定结果。光学显微镜下观察，根据棕黄色阳性信号的强弱和面积判断结果：阳性细胞数<10%为阴性表达；10%～50%为阳性表达；>50%为强阳性表达。结果判断，①按阳性细胞百分率计分：阳性细胞数≤10%为0分；11%～50%为1分；>50%为2分。②按染色强弱计分：淡黄色为0分；黄色为1分；棕黄色为2分。两项分数相加得0～1分为阴性；2～3分为阳性；4分为强阳性；0分和1分为-；2分为+；3分为++；4分为+++。

1.4 统计学分析

实验数据资料统计采用统计学软件SPSS for Window 11.0(SPSS Inc.,U.S.A)做四格表的卡方检验，Spearman相关分析。

2 结果

2.1 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌转移组和非转移组中的表达情况

鼻咽癌转移组与非转移组中E-cadherin和Vimentin阳性表达率分别为62.3%(33/53)、60.4%(32/53)和84.4%(65/77)、27.3%(21/77)。转移组与非转移组E-cadherin 和Vimentin表达比较有显著性差异(P<0.01)；鼻咽癌转移组与非转移组相比，Vimentin阳性表达水平明显上调，而E-cadherin阳性表达水平则明显下调，见表1。

2.2 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌原发灶及其配对淋巴结转移灶中的表达情况

鼻咽癌原发灶及其配对淋巴结转移灶中E-cadherin和Vimentin阳性表达率分别为78.3%(18/23)、65.2%(15/23)和47.8%(11/23)、30.4%(18/23)。E-cadherin和Vimentin阳性表达率鼻咽癌原发灶与其配对淋巴结转移灶比较有显著性差异(P<0.05)，鼻咽癌原发灶与其配对淋巴结转移灶相比，E-cadherin阳性表达水平明显下降，其中表达缺失相对少见，大部分为异常表达即由胞膜定位转变为胞质内表达，鼻咽癌原发灶内Vimentin阳性表达较多见，主要见于梭形癌细胞和少数上皮样癌细胞，而淋巴结转移灶中Vimentin阳性表达水平下调，多见于梭形癌细胞和少数上皮样癌细胞，而泡状核癌细胞一般呈阴性表达，见表1。

表1 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌、原发灶及其配对淋巴结转移灶中的表达情况(例，%)

注：▲为与转移组比较，P<0.01；*为与原发灶比较，P<0.05

2.3 鼻咽癌中Vimentin与E-cadherin表达的相关性

鼻咽癌转移组中，Vimentin与E-cadherin表达呈负相关性，Spearman相关分析结果为:γ=-0.448，P=0.001，见表2。

表2 鼻咽癌转移组中Vimentin和E-cadherin表达的相关性

鼻咽癌非转移组中，Vimentin与E-cadherin表达呈负相关性，Spearman相关分析结果为：γ=-0.356，P=0.001，见表3。

表3 非转移组中Vimentin与E-cadherin表达的相关性

2.4 鼻咽癌原发灶及其配对淋巴结转移灶中Vimentin与E-cadherin表达的相关性分析

在鼻咽癌原发灶中，Vimentin与E-cadherin表达无相关性，Spearman相关分析结果为：γ=-0.010，P=0.963，见表4。在鼻咽癌配对淋巴结转移组中，Vimentin与E-cadherin表达无相关性，Spearman相关分析结果为：γ=0.228，P=0.296，见表5。

表4 鼻咽癌原发灶中Vimentin与E-cadherin表达的相关性

表5 鼻咽癌配对淋巴结转移灶中Vimentin和E-cadherin表达的相关性

3 讨论

EMT是近年研究肿瘤转移的一个热点，而EMT与黏附分子功能的改变密切相关[5,8]。 EMT是指上皮细胞向间叶细胞细胞表型转换，在此过程中上皮细胞失去极性，细胞-细胞及细胞-间质之间的黏附性发生改变，细胞内的肌动蛋白重排，最终细胞获得更强的迁移、侵袭和转移能力。现在多数学者认为，EMT是上皮源性肿瘤转移最为关键的步骤和非常重要的条件[9～11]。在EMT过程中，上皮性肿瘤细胞最主要的表型变化是向间叶转换，其中最常应用和公认的指标是检测其E-cadherin和Vimentin表达的情况[12～14]。

E-cadherin是1种分子量为120 kD的跨膜单链多肽糖蛋白，其胞质内羧基端与α-、β-、和γ-连还素(catenins)形成E-cad/cat复合体，然后此复合体与细胞内肌动蛋白微丝系统发生结构上的联系，通过介导细胞间的黏附和信号转导，参与调节组织发生与形态分化，对细胞的识别、迁移等行为发挥非常重要的作用。任何因素改变E-cad/cat复合体中各个成分的表达、结构或破坏复合体与细胞骨架连接，都会导致E-cad/cat复合体功能的下降或丧失，导致细胞间黏附性下降，最后引起细胞的分离和移动。目前很多研究揭示，E-cad表达下调或缺失是导致恶性肿瘤转移的关键因素之一[15]。除了E-cad表达下调可影响E-cad/cat复合体的功能，E-cad表达部位也与其功能密切相关：因E-cad是Ca2+依赖性的，当Ca2+浓度下降时，不仅使Ca2+胞外5个重复系列的构型发生改变，蛋白酶作用位点曝露，以致膜上E-cad被降解，而且可使细胞内骨架成分如肌动蛋白等成分在细胞内重新分布，从细胞膜进入到细胞质中，E-cad的不能定位于细胞膜而丧失其介导细胞黏附的功能，使细胞之间变的松散。

除了具有重要黏附分子的功能以外，最近研究还发现E-cad/cat与肿瘤的上皮-间叶转换(epithelial-mesenchymal transtition,EMT)密切相关[5,8]。在我们130例鼻咽未分化型非角化性癌的病例中，其中淋巴结转移组中Vimentin阳性表达率明显高于非转移组，两组比较在统计学上有显著性差异，这说明鼻咽癌表型的改变即具有某些间叶特征的肿瘤细胞更易发生转移。未分化型非角化性癌占所有的鼻咽癌90%以上，其中形态呈梭形的又占有相当的比例，部分病例显示上皮样与梭形混合存在，是一个非常典型的具有异质性的恶性肿瘤。我们研究发现呈梭形的鼻咽癌细胞Vimentin的阳性表达较强，往往呈片块状阳性，而上皮样的癌细胞Vimentin阳性表达较弱，往往显示点灶状阳性，有时在部分区域的可以看到2种形态癌细胞并存，其Vimentin阳性表达会显示明显的差异性，表现为梭形的癌细胞阳性表达往往强于其临近的上皮或泡状核癌细胞，以上的形态学和免疫组织化学结果，支持了部分上皮源性恶性肿瘤向间叶转化的假说，同时也揭示EMT样改变与鼻咽癌的转移密切相关，这与一些学者在其它上皮上皮源性恶性肿瘤观察的结果是相吻合的[16～18]。为了进一步证实鼻咽癌细胞转移与细胞黏附分子缺失和间叶转换间的关系，我们对23例鼻咽癌原发灶和其配对淋巴结转移灶同时进行E-cadherin和Vimentin免疫组织化学染色，免疫组化结果显示淋巴结转移灶中E-cadherin阳性表达水平明显低于其相对应的鼻咽癌原发灶，表达完全缺失相对少见，大部分阳性为异常表达即胞质内表达，这说明在转移过程中，E-cad的构型发生了改变，蛋白酶作用位点曝露，以致膜上E-cad被降解，而且可能使细胞内骨架成分如肌动蛋白等成分在细胞内重新分布，从细胞膜进入到细胞质中，E-cad的不能定位于细胞膜而导致cad/cat复合体功能的障碍影响了细胞黏附功能，使细胞之间变松散。同时，我们也观察到鼻咽癌原发灶中Vimentin阳性表达水平明显高于其配对淋巴结转移灶，并具有显著性差异，说明在转移最初阶段Vimentin发挥重要作用，同样，Vimentin阳性也预示其转移的可能性增加，这与有些学者观察的结果相吻合[16]。引起这种Vimentin改变机制有许多假说和理论，但目前仍然不完全清楚，不同的学者通过研究不同的样本得出不同的结论[19～22]。有学者研究显示鼻咽癌的EMT与EB病毒感染密切相关[23]。

通过Spearman相关分析我们发现，在未分化型非角化性癌淋巴结非转移组中，Vimentin蛋白表达与E-cadherin蛋白表达呈负相关，表现为Vimentin蛋白表达水平明显上调，而E-cadherin蛋白表达水平显著下调。而在转移组中，Vimentin蛋白表达与E-cadherin蛋白表达呈负相关，表现为Vimentin蛋白表达上调，E-cadherin蛋白表达下调，这说明Vimentin与E-cadherin表达密切相关，而23例未分化型非角化性癌原发灶与其配对淋巴结转移灶中，Vimentin蛋白表达与E-cadherin蛋白表达Spearman相关分析结果揭示了同样的趋势，但在统计学方面无相关性，这可能与我们收集的样本数量过少有关。

总之，我们的研究提示，鼻咽未分化型非角化性癌具有EMT样作用，同时其EMT与肿瘤的转移密切相关，这为以后研究肿瘤转移发生的机制及其防治提供新的思路。

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