宏基因组技术及其在厌氧消化研究中的应用

季军远，邢雅娟，郑 平

（浙江大学环境工程系，浙江杭州 310058）

宏基因组技术及其在厌氧消化研究中的应用

季军远，邢雅娟，郑 平

（浙江大学环境工程系，浙江杭州 310058）

在介绍基因（组）富集、基因（组）DNA提取、文库构建及筛选等宏基因组技术的基础上，论述了宏基因组技术在厌氧消化研究中应用的重要性，认为该技术可成为研究微生物群落多样性的首选技术之一，有助于了解厌氧消化微生物的多样性、生态功能和动态变化，揭示厌氧消化微生物学机理，提高厌氧消化效能等.同时宏基因组技术为微生物资源的深层次开发利用提供了技术平台，并在工业、农业、海洋等领域具有广泛的应用前景.

宏基因组技术；文库构建；文库筛选；厌氧消化；微生物群落

微生物是自然界分布最广、种类最多、数量最大的生物类群，占生物总量的60%.其在工业、农业、环境保护等领域发挥着无可替代的作用.但迄今为止，可获得纯培养的微生物只有0.1%～1%，极大限制了人类对微生物资源的开发利用.1998年Handelsman［1］等发起宏基因组（Metagenomes）研究，引起了科学技术界的高度关注，也标志着人类利用微生物资源进入了一个新的时期.本文论述并分析了宏基因组技术及其在厌氧消化研究中的应用，力争为同行从事相关研究提供借鉴.

1 宏基因组技术

宏基因组技术依托于基因组学技术，其关键技术包括基因（组）富集、基因（组）DNA提取、文库构建、文库筛选等（见图1）［2］.

1.1 基因（组）富集

为提高功能基因检出率，减少筛选过程的复杂程度，需对目的DNA进行富集［3］.基因（组）富集可分为细胞水平富集与基因水平富集.细胞水平富集利用微生物物理、化学或生物特性的不同，通过选择性培养基富集目标微生物，如利用含羟甲基纤维素培养基富集含纤维素酶微生物［4］.此方法可高效富集快速生长菌群，但也会富集一些慢速生长菌群；基因水平富集包括稳定同位素探针（Stable Isotope Probing，SIP）技术、抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术、差异基因表达（Differential gene expression analysis，DGE）技术、噬菌体展示（Phage display）技术、亲和捕获（Affinity capture）技术及DNA芯片（Microarrays）技术等.

图1 宏基因组文库构建及筛选流程图Fig.1 The diagram of construction and screening strategies of metagenomic library

1.1.1 稳定同位素探针技术

这项技术是利用天然存在的不具放射性的同位素标记底物，富集参与特定代谢过程的微生物［5］.该技术已用于新功能基因筛选、分离等［6］，可直接检测群落中具有特定代谢活性的菌群，无需预知其特性及存在状态；但该技术所需的底物标记量较大［7］，且难以获得慢生型菌群中的功能基因.Li等［8］利用SIP技术研究了固体废弃物厌氧消化反应器中微生物种类，共对567个细菌、448个古菌的16SrRNA序列进行了分析并建立了文库，结果表明在不同培养条件下，厌氧微生物群落的组成及优势菌群也不相同.Manefield等［9］利用SIP技术研究了好氧生物反应器中的苯酚降解菌群，确认主要功能菌群为陶厄氏菌属.Sul等［10］利用SIP技术发现了新的联苯降解基因并对其进行了克隆表达.近年来，5-溴-2-脱氧尿苷同位素探针技术（BrdUTP）已逐渐成为SIP替代技术［11］.

1.1.2 抑制性消减杂交技术

这项技术是以抑制性PCR（Polymerase Chain Reaction）反应为基础的cDNA消减杂交技术，可选择性扩增目的cDNA基因片段.主要用于基因定位克隆、基因分离鉴定等，可实现高通量，单次循环即可扩增目的基因1 000倍；但该技术仅能区分种群间的差异基因.Susan等［12］利用该技术鉴定了特定环境条件下原核生物的不同表达基因，并建立了宏基因文库.Steele等［13］采用该技术研究了致病性大肠杆菌O157∶H7的基因特性.

1.1.3 差异基因表达技术

这项技术被广泛用于基因转录过程的差异性分析，可分为封闭DGE技术和开放DGE技术［14］.在DGE技术的基础上又衍生了多种改良技术，如生物素选择性扩增及限制性富集技术（selective amplification via biotin and restrictionmediated enrichment，SABRE）［15］、基因鉴定整合技术（integrated procedure for gene identification，IPGI）、基因表达系统分析（serial analysis of gene expression，SAGE）［16］、表达序列标签串联排列连接（tandem arrayed ligation of expressed sequence tags，TALEST）［17］、总基因表达分析（total gene expression analysis，TOGA）、差异显示（differential display，DD）等.这些技术已被广泛应用于探索真核生物基因和研究医学宏基因组等，具有高灵敏性、高选择性，可分析拷贝基因表达的差异性.

1.1.4 其他富集技术

噬菌体展示技术［18］利用表面蛋白与固定配位体进行选择性亲和富集DNA，是实现高通量筛选的主要富集技术之一，但存在对小于50kDa的蛋白质表达不足的问题.亲和捕获技术［19］通过共价结合在固体载体上的寡核苷酸片断对目的基因进行亲和捕获富集DNA片段，该技术的应用受限于杂交速率，可通过采用mRNA或单链DNA取代寡核苷酸得到改进.DNA芯片技术［20］可实现多目的基因高流量自动筛选，通过基因标签对目的基因进行富集，可用于宏基因组鸟枪测序过程的预筛，其作为新型基因富集技术具有广阔的应用前景.

1.2 基因（组）DNA提取

获得高浓度、高质量的DNA是宏基因组文库构建的关键之一.DNA提取可分为直接提取和间接提取.直接提取法直接破碎细胞，提取、纯化外释DNA，可又分为温和裂解（Soft lysis）与烈性裂解（Harsh lysis）.温和裂解利用化学试剂或酶裂解细胞，反应条件温和；烈性裂解利用玻璃珠、超声波等产生的物理机械力破碎细胞，可实现高效提取.直接提取法具有操作简便、成本低、提取率高及完整性好等特点，主要用于小片段基因组文库的构建.但存在DNA提取不完全、片段较小（1～50kb）、部分DNA易被环境样品吸附等不足［21］，间接提取法先分离目标微生物后将细胞破碎提取DNA，利用梯度离心、超顺磁硅磁铁纳米颗粒或脉冲场凝胶电泳等方法分离纯化DNA，主要用于原核微生物DNA提取，可获得大片段DNA（20～500kb），具有纯度高、杂质干扰少的特点，适合构建大片段的宏基因组文库，但存在操作烦琐、成本高、偏差大、DNA获得率低、易失物种信息等缺点.

1.3 宏基因组文库的构建

1.3.1 载体选择

载体的选择主要取决于插入基因片段的大小、外源基因表达相对重要性等.载体按其性质可分为大插入片段载体、表达载体及穿梭载体.大插入片段载体广泛用于宏基因组文库的构建，主要包括细菌人工染色体载体（BAC）与Cosmid载体等.BAC载体可插入350kb DNA片段，可获得代谢途径中完整功能操纵子，已应用于代谢途径多基因簇的分离［22］.Cosmid载体主要用于25～35kb DNA片段的克隆，其克隆效率比BAC载体高100～1 000倍，但其插入片段不能超过40 kb.目前BAC、pBeloBAC11、Cosmid、superCos1已成功应用于土壤中抗生素合成基因克隆［23-26］.表达载体主要包括质粒、噬菌体等，可有效克服E.coli对外源启动子的识别障碍［27］，载体一般含有诱导启动子以避免毒性物质结构表达对宿主细胞的损伤，可有效调整克隆过程，但其只能插入小片段DNA，且启动子仅能使毗连基因沿特定方向表达.Henne等［28-29］已成功应用pBluescript SK（＋）载体对脂肪酶、酯酶及羟基丁酸脱氢酶进行克隆表达.穿梭载体可在不同宿主间进行基因传递、表达，既可保留文库基因的长度，又可解决低水平表达所带来的问题.Wang等［30］利用E.coli-Sinorhizobium穿梭载体成功筛选到D-3-羟基丁酸盐降解基因.

1.3.2 宿主选择

宿主选择应主要考虑转化需要、载体在宿主细胞中的稳定性、文库构建目的等因素.不同的研究目标应选择不同的宿主.E.coli是最常用的宿主，其操作简单、繁殖迅速、代谢易于控制，但其阳性克隆数量少，不能表达真核DNA，其无同源结合基因recA与recBC及同源限制基因mcrA与mcrBC，严重限制了筛选的普遍性.Gabor等［31］认为由于E.coli中缺少某些基因表达所需的转录因子、翻译因子等，其仅能克隆表达全部基因的40%.链霉菌和假单胞菌也常作为构建文库的宿主，具有不同的表达能力，可对大范围的目的基因或操纵子的表达进行检测［32］.从复杂的宏基因组中筛选目的基因十分困难且费时，因此对宿主探索与开发是有效开发宏基因组资源的关键技术之一.

1.4 宏基因组文库的筛选

微生物种类繁多，其DNA具有高度复杂性，需要高灵敏度、高通量的技术对其进行筛选.DNA筛选方法主要分为功能／活性筛选法（Function／activity-based screening）、序列筛选法（Sequence-based screening）.

1.4.1 功能／活性筛选法

该法是获得功能基因最直接的方法，可直观显现基因组文库中具有特殊功能／活性的克隆子.功能基因的获得取决于宿主-载体系统、目的基因大小及丰度、分析手段、异源基因在宿主中表达效率等.功能／活性筛选主要通过产生可见特征（如颜色、菌斑等）筛选阳性克隆.其操作简便、通量高，但其低阳性率会引起信号特征不明显，且克隆基因在宿主中的偏好表达限制了其应用.近年来对该法已进行了相关的改进：①利用细胞溶菌液进行筛选，将溶菌液与底物混合，可提高筛选灵敏度；②将目的基因活性与宿主细胞存活能力结合进行筛选，以达到高敏度及高通量，主要用于筛选抗生素或抗重金属基因［33-34］；③报告基因技术.

底物诱导基因表达筛选法（Substrate-Induced Gene Expression Screening，SIGEX）已广泛应用于宏基因组文库的筛选，利用代谢产物诱导相关基因或酶的表达，为高通量筛选提供了技术保障.Uchiyama等［35］分别利用苯酚、安息香酸盐或萘等为底物，结合荧光激活细胞分离（FACS）技术，从环境宏基因组文库中成功筛选出具有特定生物代谢功能的阳性克隆.

1.4.2 序列分析法

序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，是发现和认识基因多态性的前提.其主要用于对现存基因文库进行拓展性鉴别，利用依据保守序列设计的寡核苷酸引物或探针，通过PCR、基因杂交等分子生物学手段对目的基因进行筛选，其应用受PCR反应偏好、载体与宿主结合的稳定性、基因拷贝数变化等因素影响.由于引物的设计依赖于已有的序列信息，因此很难发现新的功能基因；且仅能筛选部分内在基因序列，要获得其完整基因序列还需克隆出其侧翼基因.序列分析技术已被用于鉴定系统发育学中的标志基因和带有高度保守域的酶基因.Yamada等人［36］利用PAI-PCR方法分离得到传统IPCR无法获得的糖基水解酶，将灵敏度提高了104倍.Meyer等人［37］利用消减杂交磁珠捕获（Subtractive hybridization magnetic bead capture）技术成功的筛选得到新型多铜氧化酶，相比传统的PCR技术，此方法能在单反应中同时筛选多个目的基因.

通过对宏基因组测序可获得丰富的基因信息，多种测序技术已获成功应用.鸟枪法测序（Shotgun sequencing）将完整的目标序列随机打断成小片段后测序，可筛选新的天然产物，并可获得大量信息，主要应用于单个生物基因组的测序，其消耗大量人力、物力和财力.覃俊杰等人［38］收集124个欧洲人肠道菌群的样本，利用鸟枪测序技术对不同人肠道菌群近6×1011的碱基序列进行序列组装和基因注释分析，从中获得3.3×106个非冗余的人体肠道元基因组，约是人自身基因的150倍，从而估算出人肠道中存在1 000～1 150种细菌，平均个体内约含有160种优势菌种.Strous［39］等利用此技术对厌氧氨氧化生物反应器中的微生物群落进行了全基因研究，并分析了生物反应器中的生物多样性.焦磷酸序列（Pyrosequencing）适用于各种环境生物多样性的研究，可对全基因组进行测序，可更全面的获得微生物基因信息.454焦磷酸序列测序已在商业中得到应用，已成功开发了GS20和GS FLX产品.

2 宏基因组技术在厌氧消化研究中的应用

厌氧消化过程实质上是厌氧微生物以生理群为单位组成微生态对废物进行协同代谢产沼气的技术，是一个复杂而有序的生物反应过程.厌氧消化微生物从功能上可分为发酵细菌、产氢产乙酸细菌、同型产乙酸细菌、产甲烷细菌四大菌群，不同菌群之间相互依赖，互为对方创造与维持代谢及生长所需要的良好环境条件.在厌氧消化中，由于菌源和废物成分复杂，会形成多种多样的微生物群落，厌氧消化微生物代谢途径丰富、代谢通量大，是废物厌氧消化技术高效的本质.在消化过程中微生物群落多样性及与环境构成的微生物生态系统，从根本上决定了厌氧消化反应技术的潜能.

厌氧消化过程形成的群落结构，增加了对其结构及功能鉴定的复杂性.宏基因组技术可成为厌氧消化处理中研究微生物群落多样性的首选技术，不仅加深对其群落结构的认识，全面掌握厌氧消化反应器中微生物组成多样性，分析环境条件引发的群落演替规律；而且可从遗传多样性层面揭示生态规律，为研究厌氧消化微生物群落结构、功能提供研究策略，揭示微生物降解废物的机理.Wang［40］等采用宏基因组技术研究了野草青贮厌氧消化微生物群落的构成及演变，建立了克隆文库并进行了分析，得出不同环境条件下其群落组成、结构及功能菌群丰度会发生相应变化，优势菌群发生相应的转变.Xu［41］等通过建立克隆文库研究了氯仿、2-溴乙烷磺酸盐两种抑制剂对产甲烷群落结构的影响，乙酸营养型的甲烷鬃毛菌相对于氢营养型的甲烷杆菌与甲烷微菌更易受到抑制剂的影响，且同型产乙酸菌活性增强.Kroeber［42］等利用宏基因组技术研究了以玉米青贮、麦秆、粪便为原料的厌氧发酵产沼实际工程反应器中的厌氧微生物生物多样性及群落组成，发现其获得的核酸序列相比其他厌氧消化或厌氧生物反应器中的序列库其生物多样性存在明显差异，群落构成也存在明显不同，且许多微生物迄今为止为未知或未分类的种群.

3 展 望

宏基因组学已成为微生物学、生态学、土壤学等领域的热点研究方向，已在生物多样性、新功能基因发现及活性物质筛选等研究领域获得广泛应用.该技术可了解生物多样性，掌握生物群落结构，分析微生物生态特性，重建生物群落功能等［43］，有助于了解微生物与环境生态因子之间的相互作用、协同进化关系，了解不同环境条件下微生物种群及群落演变特性，了解优势种群及其生理与功能特征.

宏基因组学技术在高含量高质量DNA提取分离、大片段高稳定性载体构建及高表达活性的宿主选择等技术层面仍存在不足，需进一步研究改善.宏基因组学是以环境DNA为基础，在研究过程中会不可避免的丢失部分多样性内容，若将其与宏转录组学、宏蛋白质组学结合应用，将会对微生物生态研究产生更大的推动作用.宏基因组技术更广泛的应用将得力于多技术之间的交叉融合，如引入融合纳米技术、统计分析技术、计算机技术等.

宏基因组技术必将成为厌氧消化生物多样性、生物功能及代谢途径研究的必选技术，可为获得厌氧消化微生物生理生化信息提供技术平台，可用于预测或探明特定代谢途径及功能基因等，可促进厌氧消化微生物功能发掘及高效厌氧消化技术的开发.

［1］Handelsman J，Rondon M R，Brady S F，et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products［J］.Chemistry ＆Biology，1998，5（10）：245-249.

［2］Miller D N，Bryant J E，Madsen E L，et al.Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65（10）：4715-4724.

［3］Knietsch A，Bowien S，Whited G，et al.Identification and characterisation of coenzyme B12-dependent glycerol dehydratase-and diol dehydratase encoding genes from metagenomic DNA libraries derived from enrichment cultures［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（6）：3048-3060.

［4］Rees H C，Grant W D，Jones B E，et al.Diversity of Kenyan soda lake alkaliphiles assessed by molecular methods［J］.Extremophiles，2004，8（1）：63-71.

［5］Radajewski S，Ineson P，Parekh N R，et al.Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology［J］.Nature，2000，403（6770）：646-649.

［6］Kalyuzhnaya M G，Lapidus A，Ivanova N，et al.Highresolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities［J］.Nature Biotechnology，2008，26（8）：997-998.

［7］Radajewski S，McDonald I R，Murrell J C.Stable-isotope probing of nucleic acids：a window to the function of uncultured microorganisms［J］.Current Opinion Biotechnology，2003，14（3）：296-302.

［8］Li T L，Mazeas L，Sghir A，et al.Insights into networks of functional microbes catalysing methanization of cellulose under mesophilic conditions［J］.Environmental Microbiology，2009，11（4）：889-904.

［9］Manefield M，Whiteley A S，Griffiths R I，et al.RNA stable isotope probing，a novel means of linking microbial community function to phylogeny［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（11）：5367-5373.

［10］Sul W J，Park J，Quensen J F，et al.DNA-stable isotope probing integrated with metagenomics for retrieval of biphenyl dioxygenase genes from polychlorinated biphenyl contaminated river sediment［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75（17）：5501-5506.

［11］Yin B，Crowley D，Sparovek G，et al.Bacterial functional redundancy along a soil reclamation gradient［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（10）：4361-4365.

［12］Delong S K，Kinney K A，Kirisits M J.Prokaryotic suppression subtractive hybridization PCR cDNA subtraction，a targeted method to identify differentially expressed genes［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（1）：225-232.

［13］Steele M，Ziebell K，Zhang Y，et al.Genomic regions conserved in lineage II escherichia coli O157∶H7strains［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75（10）；3271-3280.

［14］Green C D，Simons J F，Taillon B E，et al.Open systems：panoramic views of gene expression［J］.Journal of Immunological Methods，2001，250（1／2）：67-79.

［15］Lavery D J，Lopez M L，Fleury O F，et al.Selective amplification via biotin-and restriction-mediated enrichment（SABRE），a novel selective amplification procedure for detection of differentially expressed mRNAs［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1997，94（13）：6831-6836.

［16］Velculescu V E，Zhang L，Vogelstein B，et al.Serial analysis of gene expression［J］.Science，1995，270（5235）：484-487.

［17］Spinella D G，Bernardino A K，Redding A C，et al.Tandem arrayed ligation of expressed sequence tags（TALEST）：a new method for generating global gene expression profiles［J］.Nucleic Acids Research，1999，27（18）：e22.

［18］Crameri R，Suter M.Display of biologically active proteins on the surface of filamentous phages：a cDNA cloning system for the selection of functional gene products linked to the genetic information responsible for their production［J］.Gene，1993，137（1）：69-75.

［19］Demidov V V，Bukanov N O，Frank K D.Duplex DNA capture［J］.Current Issues in Molecular Biology，2000，2（1）：31-35.

［20］Wu L，Thompson D K，Li G，et al.Development and evaluation of functional gene arrays for detection of selected genes in the environment［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67（12）；5780-5790.

［21］Miller D N，Bryant J E，Madsen E L，et al.Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65（11）：4715-4724.

［22］Courtois S，Cappellano C M，Ball M，et al.Recombinant environmental libraries provide access to microbial diversity for drug discovery from natural products［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）：49-55.

［23］Brady S F，Clardy J.Long-chain N-acyl amino acid antibiotics isolated from heterologously expressed environmental DNA［J］.Journal of the American Chemical Society，2000，122（51）：12903-12904.

［24］Brady S F，Chao C J，Handelsman J，et al.Cloning and heterologous expression of a natural product biosynthetic gene cluster from eDNA［J］.Organic Letters，2001，3（13）：1981-1984.

［25］MacNeil I A，Tiong C L，Minor C，et al.Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries［J］.Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2001，3（2）：301-308.

［26］Gillespie D E，Brady S F，Bettermann A D，et al.Isolation of antibiotics turbomycin A and B from a metagenomic library of soil microbial DNA［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，68（9）：4301-4306.

［27］Newman J R，Fuqua C.Broad-host-range expression vectors that carry the L-arabinose-inducible Escherichia coli araBAD promoter and the araC regulator［J］.Gene，1999，227（2）：197-203.

［28］Henne A，Daniel R，Schmitz R A，et al.Construction of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the presence of genes conferring utilization of 4-hydroxybutyrate［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65（9）：3901-3907.

［29］Henne A，Schmitz R A，Bömeke M，et al.Screening of environmental DNA libraries for the presence of genes conferring lipolytic activity on Escherichia coli［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（7）：3113-3116.

［30］Wang C，Meek D J，Panchal P，et al.Isolation of poly-3-hydroxybutyrate metabolism genes from complex microbial communities by phenotypic complementation of bacterial mutants［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72（1）：384-391.

［31］Gabor E M，Alkema W B，Janssen D B.Quantifying the accessibility of the metagenome by random expression cloning techniques［J］.Environmental Microbiology，2004，6（9）：879-886.

［32］Martinez A，Kolvek S J，Yip C L，et al.Genetically modified bacterial strains and novel bacterial artificial chromosome shuttle vectors for constructing environmental libraries and detecting heterologous natural products in multiple expression hosts［J］.Applied and Environmental Microbiology，2004，70（4）：2452-2463.

［33］Mori T，Mizuta S，Suenaga H，et al.Metagenomic screening for bleomycin resistance genes［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（21）：6803-6805.

［34］Kazimierczak K A，Scott K P，Kelly D，et al.Tetracycline resistome of the organic pig gut［J］.Applied and Environmental Microbiology，2009，75（6）：1717-1722.

［35］Uchiyama T，Abe T，Ikemura T，Watanabe K.Substrateinduced gene expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes［J］.Nature Biotechnology，2005，23（1）：88-93.

［36］Yamada K，Terahara T，Kurata S，et al.Retrieval of entire genes from environmental DNA by inverse PCR with pre-amplification of target genes using primers containing locked nucleic acids［J］.Environmental Microbiology，2008，10（4）：978-987.

［37］Meyer Q C，Burton S G，Cowan D A.Subtractive hybridization magnetic bead capture：a new technique for the recovery of fulllength ORFs from the metagenome［J］.Biotechnology，2007，2（1）：36-40.

［38］Qin J，Li R，Raes J，et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing［J］.Nature，2010，464（7285）：59-67.

［39］Strous M，Pelletier E，Mangenot S，et al.Deciphering the evolution and metabolism of an anammox bacterium from a community genome［J］.Nature，2006，440（7085）：790-794.

［40］Wang H，Vuorela M，Keränen A L，et al.Development of microbial populations in the anaerobic hydrolysis of grass silage for methane production［J］.FEMS Microbiology Ecology，2010，72（3）：496-506.

［41］Xu K W，Liu H，Chen J.Effect of classic methanogenic inhibitors on the quantity and diversity of archaeal community and the reductive homoacetogenic activity during the process of anaerobic sludge digestion［J］.Bioresoure Technology，2010，101（8）：2600-2607.

［42］Kröber M，Bekel T，Diaz N N，et al.Phylogenetic characterization of a biogas plant microbial community integrating clone library 16S-rDNA sequences and metagenome sequence data obtained by 454-pyrosequencing［J］.Journal of Biotechnology，2009，142（1）：38-49.

［43］Blow N.Metagenomics：Exploring unseen communities［J］.Nature，2008，453（7195）：687-692.

Metagenomic Technology and Its Application in Anaerobic Digestion Research

JI Junyuan，XING Yajuan，ZHENG Ping

（Department of Environmental Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

The metagenomic technology is introduced，which is composed of enrichment of gene DNA，extraction of DNA，construction and screening of clone libraries，etc.Metagenomic technology can make it possible to enormously amplify the space of microbial resource utilization；it has been broadly applied in industry，agriculture and ocean etc.This methodology is of great potential for use in anaerobic digestion research，it can be used to study microbial diversity in anaerobic digestor，enable to peep at more complete scenario of microbial communities and to better find out the spatial distribution and spatio-temporal dynamics of microorganisms in anaerobic digestor，it also can reveal the microbial mechanism of anaerobic digestion，enhance efficiency of digestion reactors.Metagenomic technology provides a technology platform for the deep-seated development and utilization of microbial resources；it has broad prospects in the field of industrial，agricultural，marine and other applications.

metagenomic technology；libraries construction；libraries screening；anaerobic digestion；microbial community

Q 93

A

1008-9225（2012）04-0001-06

2012-02-14

国家高技术研究发展计划“863”滚动支撑项目（2009AA06Z311）；浙江省重大科技专项（2010C13001）.

季军远（1980-），男，山东烟台人，浙江大学博士研究生.

王 颖】