变异血红蛋白和氨基甲酰血红蛋白对糖化血红蛋白测定干扰的评价

康建华，杨立顺，袁海生

(天津市中医药大学附属北辰中医医院检验科，天津300400)

糖尿病的慢性高血糖症会造成患者的长期损害、机能障碍、多种器官衰竭。2009年的研究建议将糖化血红蛋白(HbA1c)检测作为筛选和诊断糖尿病指标［1］。由此可见，HbA1c的检测质量在糖尿病的诊治中起着举足轻重的作用。由于受各种因素干扰，如:红细胞生存期的改变、异常血红蛋白、黄疸和高脂血症、乙酰化血红蛋白、氨基甲酰化血红蛋白等因素均可造成HbA1c值出现假性升高或降低，所有检测方法都存在非特异性。离子交换-高效液相色谱法(HPLC)检测HbA1c被认为是国际标准化的检测方法。近年来临床上又新出现了另外一种检测HbA1c的方法——酶法。我们通过使用2种不同原理的方法同时检测患者的HbA1c并进行比较分析，评价2种方法的抗干扰能力。

材料和方法

一、对象

2009年12月至2010年10月在天津市中医药大学附属北辰中医医院住院的2型糖尿病患者30例，除外尿毒症、贫血患者，其中男22例、女18例，年龄30～70岁。同时收集20名健康体检者EDTA-K2抗凝血作为正常对照组。糖尿病的诊断标准符合世界卫生组织(WHO)1999年诊断标准。另外选择天津市中医药大学附属北辰中医医院住院透析的糖尿病尿毒症患者8例，并采集新生儿脐带血1份。门诊患者空腹取静脉血测定HbA1c，病房患者在入院第2天取静脉血测定HbA1c，所有样本都当天检测。

二、试剂和仪器

美国Bio-Rad公司生产的D-10糖化血红蛋白检测仪(简称D-10检测仪)、配套试剂、HbA1c校正液和低、高值质控液，D-10检测仪可溯源到美国国家HbA1c标准化程序(NGSP)［2］。TBA-40全自动生化分析仪。北京九强生物技术有限公司生产的HbA1c酶法检测试剂盒及配套校准品、质控品和操作参数。依据ISO/DIS 17511“校准物质和质控物质定值的计量学溯源性”，北京九强生物技术有限公司HbA1c酶法试剂可溯源至NGSP。

三、检测方法及原理

1.严格按仪器和试剂的标准操作规程检测样本，按要求进行室内质控。D-10检测仪的原理为离子交换-HPLC，是基于HbA1c与其他血红蛋白电荷的不同对HbA1c进行分离。酶法原理是在蛋白酶的作用下，切断HbA1c的β链N末端的糖化二肽，糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成过氧化氢，在过氧化物酶的存在下与显色剂产生显色反应，通过测定吸光度值求出HbA1c的百分浓度。

2.不同浓度HbF的制备 将30例糖尿病患者样本混匀用2种检测方法各检测3次HbA1c浓度(离子交换-HPLC:8.0%、7.92%、8.10%;酶法:8.12%、7.86%、7.90%)，计算HbA1c均值为8.0%，将新生儿脐带血液样本［胎儿血红蛋白(HbF)浓度约为70%［3］］与混匀后的糖尿病患者血液样本按1∶9混合，使混合样本HbF浓度约为7%。用2种方法同时检测混合样本的HbA1c浓度(离子交换 -HPLC法:7.62%、7.58%、7.60%;酶法:7.58%、7.52%、7.70%)，取均值为7.6%。从而计算出新生儿脐带血液样本中HbA1c的浓度约为4.0%。将新生儿脐带血作为第1份，其他混合后糖尿病患者血液样本分为7份，分别加入不同浓度新生儿脐带血，将其进行1.1倍、1.4倍、2倍、3倍、4倍、8倍、16倍稀释，理论浓度分别为 70.0%、64.0%、50.0%、35.0%、23.0%、17.5%、8.8%和4.4%。

3.检测 分别用2种方法检测正常对照组、尿毒症组和含有不同浓度HbF的糖尿病组血液样本中的HbA1C浓度，每组检测3次，计算均值()和标准差(s)。

四、统计学方法

所有资料应用Excel和SPSS10.0软件进行统计学分析。各组间均数比较t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、精密度试验

取低、高质控品用2种方法在一次实验中重复测定20次，得批内精密度。每日上午检测1次，连续测定15 d，计算批间精密度，见表1。

表1 离子交换高压液相色谱法和酶法的批内及批间精密度结果

二、正常对照组及糖尿病组HPLC和酶法检测结果的相关性分析

正常对照组和糖尿病组血液样本分别用离子交换-HPLC和酶法检测并进行相关比较。以D-10检测仪测定结果为X，酶法测定结果为Y，对测定结果进行回归分析。回归方程为Y=0.938 5X+0.248 1，r2=0.975 2，r=0.986 1，P ＜0.05，两者具有良好的相关性。对于血红蛋白结构正常的各种浓度HbA1c的血液样本，2种检测系统的测定结果差异无统计学意义(P＞0.05)。

三、尿毒症组离子交换-HPLC和酶法HbA1c检测结果比较

8例糖尿病尿毒症患者分别用离子交换-HPLC和酶法检测的HbA1c进行对比，结果表明离子交换-HPLC检测结果均明显高于酶法(此8例患者从糖尿病门诊病例记录中查阅住院前2个月监测的空腹血糖水平，每周2次，从而计算出平均血糖水平)，见表2。

四、不同浓度的HbF对2种检测系统测定HbA1c的影响

当HbF＜8.75%时，离子交换-HPLC测定结果与预期值无差异;当样本中 HbF的浓度为17.50%～23.00%时，其测定结果要明显低于HbA1c的理论浓度;当 HbF浓度达35.00% ～70.00%时离子交换-HPLC无法检测出结果。酶法检测结果几乎不受HbF的干扰，见表3。

表2 2种方法测定透析的尿毒症患者HbAlc结果比较

表3 不同浓度的HbF对2种检测系统测定HbA1c的结果 (%)

讨 论

HbAlc作为监测糖尿病血糖控制的金标准［4］，为糖尿病患者提供了一项评估血糖长期控制情况指标。有规律地定期检测HbA1c，可有效地预防糖尿病及相关并发症的发生。HbA1c不同的测定方法会受到各种干扰因素的影响，对变异血红蛋白及血红蛋白衍生物的研究有助于提高HbA1c检测结果的准确性。HbF是胚胎时期的血红蛋白由2条α链和2条γ链组成。出生时，70%的血红蛋白是HbF，6个月后降到5%以下。遗传性HbF持续存在的个体体内其浓度可达到总血红蛋白的30%，而β-地中海贫血和镰状细胞病患者体内HbF的浓度占总Hb的2% ～20%不等。常见的血红蛋白化学衍生物对氨基甲酰血红蛋白在尿毒症患者血中浓度升高，是最常见的干扰HbA1c检测的化学衍生物。

本研究选用2种不同原理检测系统来分别测定各组血液样本中的HbA1c浓度。对于血红蛋白结构正常和肾功能正常者的各种浓度HbA1c的血液样本，2种检测方法的测定结果有明显相关性，都能很好的反映患者的血糖水平。批内、批间CV＜3%，2种方法均符合要求。精密度试验表明2种检测系统的准确性都很高。

从表3可知，离子交换-HPLC在HbF浓度达35.00%～70.00%时，HbA1c无法获得检测结果。当HbF＜8.75%时，测定结果与预期值无差异;当样本中HbF的浓度为17.50% ～23.00%时，其测定结果要明显低于HbA1c的理论浓度，而酶法几乎不受HbF干扰。分析原因可能为新生儿脐带血中含有大量HbF，大约为70%，其等电点与HbA1c比较接近。在检测过程中，HbA1c的峰大部分叠加在HbF峰中，所以HbA1c的值大大偏低或根本检测不出。

对于尿毒症患者，离子交换-HPLC检测出的HbA1c浓度明显高于酶法，分析原因可能是由于离子交换-HPLC是利用HbA1c与其他血红蛋白带电性的不同，通过离子交换的管柱达到分离目的，故受与HbA1c带电性相似的变异血红蛋白的影响。尿毒症患者由于肾功能严重受损，血红蛋白浓度较低，患者体内有过多的尿素生成，尿素在体内可自发地分离形成氨和氰酸盐，氰酸盐经质子化作用后形成异氰酸，异氰酸与蛋白质的α和ε氨基基团反应即形成氨基甲酰。血红蛋白β链N端的缬氨酸可与异氰酸发生特异性的结合反应，形成稳定的氨基甲酰血红蛋白。氨基甲酰血红蛋白与HbA1c的等电点相似，故可对依据电荷原理检测HbA1c的方法形成干扰。Lee等［5］发现，用离子交换色谱法测定HbA1c时，如尿素浓度超过 17 mmol/L，每升高 1 mmol/L会使HbA1c值升高0.04%。酶法HbA1c的测定是个突破，主要表现在3方面:(1)特异蛋白内切酶特异酶解血液中的血红蛋白产生果糖基氨基酸，血浆中的其他蛋白，如白蛋白、球蛋白等对结果不能产生干扰;(2)果糖基氨基酸氧化反应;(3)在溶血体系中应用了H2O2测定的灵敏性，由于过氧化氢酶可以分解色素元引起负反应，所以可用过氧化物酶代替，且不受异常血红蛋白和血红蛋白衍生物的影响，特异性强［6］。与本研究结果相符，酶法检测含不同浓度的HbF和氨基甲酰血红蛋白时的HbA1c结果与理论值相符。

总之酶法和离子交换-HPLC测定HbA1c对于血红蛋白结构正常和肾功能正常者的各种浓度HbA1c的血液样本，都能很好的反映患者的血糖水平。但酶法不易受变异血红蛋白和氨基甲酰血红蛋白的影响，且操作简便［7］，仪器设备要求不高，能在实验室原有各种生化仪进行检测，收费低廉。不同的测定方法会受到各种干扰因素的影响，对变异血红蛋白及血红蛋白衍生物的研究有助于提高HbA1c检测结果的准确性。离子交换-HPLC法虽受变异血红蛋白的干扰，但做为检测HbA1c的金标准方法，具有快速、简便、精确等特点，结果的重复性显著优于其他方法，可以通过各个不同形态图谱分析识别出变异血红蛋白的存在。如果选择高分辨率HbA1c检测试剂及仪器，HbA1c的检测结果将不受血红蛋白变异体及其衍生物的影响。本研究提醒临床医生考虑HbF和变异血红蛋白对HPLC方法的干扰，从而避免此类糖尿病患者HbA1c的误读。国际临床化学联合会(IFCC)确立的测定HbA1c的参考方法是高效液相-电喷物电离/质谱(HPLC-ESI/MS)或高效液相-毛细管电泳(HPLC-CE/UV)［8］。国内临床检验的主管部门也提倡重视HbA1c测定技术及量值溯源［9］，生产厂家、实验室加入NGSP的对比计划以推动HbA1c的标准化进程。在后续的研究中，我们将以HPLCESI/MS法为参考，对不同测定HbA1c方法的影响因素作进一步的比对研究。

［1］International Expert Committee.International expert committee report on the role of the A1C assay in the diagnosis of diabetes［J］.Diabetes Care，2009，32(7):1327-1334.

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［3］Manca L，Masala B.Disorders of the synthesis of human fetal hemoglobin ［J］.IUBMB Life，2008，60(2):94-111.

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［9］王冬环，张传宝，陈文祥，等.应重视糖化血红蛋白测定技术及量值溯源［J］.中华检验医学杂志，2008，31(9):965-968.