SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鉴定

何一，王崇树，魏寿江，王攀

(川北医学院附属医院普外科，四川 南充 637000)

SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鉴定

何一，王崇树△，魏寿江，王攀

(川北医学院附属医院普外科，四川 南充 637000)

目的:建立多药耐药人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型并探讨移植瘤的耐药特性。方法:将人胃癌细胞株SGC-7901和耐药细胞株SGC-7901/HCPT分别接种于裸小鼠左侧背部皮下和右侧背部皮下，在SPF级动物合格环境下饲养，观察肿瘤细胞成瘤情况，用MTT法比较移植瘤细胞对羟基喜树碱的敏感性及免疫组化测定其耐药基因TOPO-Ⅰ表达的变化。结果:SGC-7901和SGC-7901/HCPT裸小鼠移植成瘤率为100%，无自行消退现象。MTT法测定SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分别为4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，与移植前细胞比较，差异无统计学意义。耐药基因TOPO-Ⅰ表达分别为2.964±0.162和2.953±0.172，差异无著性意义。结论:以SGC-7901/HCPT细胞建立的裸鼠皮下耐药移植瘤模型，仍保持体外的耐药活性和基因表型，为耐药机制和逆转的研究提供了良好的动物模型。

胃肿瘤;肿瘤移植;动物

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是造成肿瘤化疗失败的主要原因［1］。为此我们利用胃癌耐羟基喜树碱细胞株SGC-7901/HCPT成功接种于裸小鼠，建立体内肿瘤耐药模型并对其耐药特性进行初步研究，为肿瘤耐药机制研究和逆转耐药药物的筛选提供一个体内模型。

1 材料和方法

1.1 细胞和动物

人胃癌细胞株SGC-7901由重庆医科大学病理生理教研室惠赠，人胃癌耐羟基喜树碱细胞株SGC-7901/HCPT由本课题组采用逐步增加药物剂量的方法诱导建立［2］。常规传代培养，取对数生长期的细胞备用。BALB/C(nu，nu)裸小鼠购自重庆医科大学动物实验中心，雌雄皆用，4～5周龄，体重21～25 g，在SPF级动物合格环境下饲养。

1.2 试剂

RPMI-1640干粉培养基:美国GIBICO公司生产;小牛血清:成都哈里生物工程有限公司生产;四甲基偶氮唑盐(MTT):美国Sigma公司生产;超净工作台:苏净集团安泰公司制造;二氧化碳孵育箱:美国Forma Scientific Inc生产;倒置荧光显微镜:日本Olympus生产;自动酶标读数仪:日本Microplate header生产;兔抗人TOPO-Ⅰ多克隆抗体购于博士德生物有限公司;免疫组化试剂盒和DAB试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 裸小鼠皮下移植瘤模型的建立

将亲代SGC-7901接种于裸小鼠左侧背部皮下，耐羟基喜树碱细胞系SGC-7901/HCPT接种于裸小鼠的右侧背部皮下，接种浓度均为1×107/mL，剂量为0.3 mL。接种第6～9天，可见裸小鼠接种部位长出肿块，用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和短径(b)，按下面公式计算肿瘤体积:V=2/3×a×b。2周后，当包块约1.0 cm大小，取出包块，去除周围纤维组织，用筛网法制备单细胞悬液，将其接种另一只裸小鼠的背部皮下，待肿瘤包块长至约1.0 cm大小，取出，重复上述操作计4次。

1.4 细胞毒试验(MTT)

在第四次肿瘤接种后3周处死裸小鼠，无菌条件下分离肿瘤组织，将新鲜瘤块用筛网法制备成单细胞悬液并接种于培养瓶内培养，将上述细胞和接种裸鼠前的细胞于指数增长期接种于96孔板，每孔含细胞104个，平行3孔，各孔定容200 μL/孔，实验孔加羟基喜树碱，wild SGC-7901和SGC-7901/nude分别加入A(0.1 μg/mL)、B(0.2 μg/mL)、C(0.4 μg/mL)、D(0.8 μg/mL)、E(1.6 μg/mL)五个浓度水平，每孔20 μL;wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nudeA分别加入(1 μg/mL)、B(2 μg/mL)、C(4 μg/mL)、D(8 μg/mL)、E(1.6 μg/mL)五个浓度水平。每孔20 μL，培养72 h，每孔加入MTT 20 μL(5 mg/L)，4 h后弃上清并加入DMOS(150 μL/孔)，充分振荡10 min，使结晶颗粒溶解，用酶标仪在590 nm处测定吸光度值(A)，按公式计算细胞抑制率(抑制率=1－实验组A值/对照组A值)。

1.5 免疫组化测定TOPO-Ⅰ表达情况

在第四次肿瘤接种后3周处死裸小鼠，无菌条件下分离肿瘤组织，将新鲜瘤块用筛网法制备成单细胞悬液，制细胞爬片，行免疫组化(S-P)法检测，按试剂盒说明操作。结果判断:排除爬片边缘细胞，10×10低倍镜下随机选取10个细胞分布视野，每个视野在10×20中倍镜下记数50个细胞。根据细胞着色强弱分为四个等级，无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分［3］。按公式HSCORE=∑Pi(I+1)(i=0、1、2、3…;Pi表示评分为I的比例)计算HSCORE得分。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 初代移植和传代成功率

SGC-7901和SGC-7901/HCPT两株胃癌细胞分别接种裸鼠于裸小鼠左侧背部皮下和右侧背部皮下，在裸小鼠左侧背部皮下和右侧背部皮下可见到肿瘤结节形成，取出移植瘤进行传代，移植成功率达到100%。尚未发现移植瘤有自发性消退现象。

2.2 裸小鼠移植瘤的耐药特性

为了明确SGC-7901/HCPT裸小鼠移植瘤经体外培养检测是否仍保持对羟基喜树碱耐药的特性，取裸小鼠移植肿瘤组织无菌条件下制成分离细胞，与羟基喜树碱对原代细胞的细胞毒作用进行比较，结果(表1)表明裸小鼠Wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分别为4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，与移植前细胞比较，其差异无统计学意义。

表1 SGC-7901/HCPT/nude细胞与SGC-7901/nude细胞对HCPT的耐药指数

2.3 裸小鼠移植瘤的耐药表型

为了明确SGC-7901/HCPT裸小鼠移植瘤是否具有耐羟基喜树碱的耐药表型，对移植瘤肿瘤免疫组织化学染色检测TOPO-Ⅰ表达水平，结果表明同移植前体外培养的Wild SGC-7901/HCPT细胞相比，SGC-7901/HCPT/nude细胞也具有TOPO-Ⅰ表达水平下降，其差异无统计学意义，表明SGC-7901/HCPT/nude仍保留耐羟基喜树碱的基因表型，见表2。

表2 SGC-7901和SGC-7901/HCPT的TOPO-Ⅰ的表达情况

3 讨论

体内建立耐药动物模型，一般有移植耐药细胞株瘤或肿瘤组织(移植型)和荷瘤动物给药诱导耐药(诱导型)两种方式。由于荷瘤动物给药诱导耐药，操作复杂，时间长，受荷瘤动物生存时间的限制，应用较少，目前实验研究多采用移植方式。实体瘤耐药移植瘤模型多采用皮下移植和原位移植两种途径，通常认为原位移植优于皮下移植模型，主要是由于能够模拟体内的器官微环境，虽能更好的反映肿瘤的形态特点和生物学行为，但由于操作复杂，创伤性大，每次接种数量有限，肿瘤深藏，不利于观察和治疗，应用受到一定程度的限制。而皮下移植肿瘤操作简单，创伤性小，肿瘤浅表便于观察和治疗，可以扩大接种数量。翟宝进等［4］比较肝癌细胞系HepG2接种裸小皮下和肝原位移植两种模型，结果发现多药耐药特性并无显著性差异，提示皮下移植肿瘤与原位移植模型具有相似的生物学行为，利于肿瘤耐药逆转剂的筛选观察。

本研究结果表明，以具有耐羟基喜树碱为特征的SGC-7901/HCPT胞建立的裸鼠移植瘤模型，不仅成瘤率高(达100%)，而且在裸鼠体内生长良好。SGC-7901/nude的IC50为0.496 μg/mL，SGC-7901/HCPT/nude的IC50为4.381 μg/mL，表明在体内情况下，移植瘤SGC-7901/HCPT/nude仍保持体外的耐药指数。wild SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分别为4.686 μg/mL和4.381 μg/mL，表明移植瘤对羟基喜树碱的耐药倍数保持稳定。耐药基因TOPO-Ⅰ的表达下降，则可能是SGC-7901/HCPT耐HCPT形成的分子基础［5－7］，SGC-7901/HCPT/nude与SGC-7901/nude比较，TOPO-Ⅰ表达水平下降，表明体内肿瘤SGC-7901/HCPT/nude仍具有耐药基因的表型，而TOPO-Ⅰ在SGC-7901/HCPT/nude与wild SGC-7901/HCPT中的表达差异性无统计意义，表明移植瘤仍保持与体外相似的耐药基因表型。

综上所述，SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤肿瘤能保持在体外培养条件下的耐药特性，其对羟基喜树碱的耐药倍数和耐药基因表型未产生改变，为建立人类肿瘤细胞多药耐药动物模型提供借鉴，亦为体内肿瘤耐药机制以及逆转耐药的研究提供良好的动物平台。

［1］Thomas H，Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer:an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein［J］.Cancer Control，2003，10(2):159－165

［2］何一，王崇树，魏寿江，等.人胃癌耐药细胞株SGC-7901/HCPT的耐药机制初探［J］.四川肿瘤防治，2007，20(1):10－12

［3］Harrington DJ，Lessey BA，Rai V，et al.Tenascin is differentially expressed in endometrium and endometriosis［J］.J Pathol，1999，187(2):242－248

［4］翟宝进，伍烽，邵泽勇，等.人肝癌移植瘤多药耐药模型的建立及耐药机制的探讨［J］.癌症，2004，23(8):905－909

［5］Fukuoka K，Adachi J，NishioKt，et al.p16INK4 expressionis associated with the increased sensitivity of human non－small cell lung cells to DNA topoisomerase l inhibitors［J］.JPn J Cancer Res，1997，88(10):1009－1016

［6］Beidler DR，Chang JY，Zhou BS，et al.Camptothecin resistance involving steps subsequent to the formation of protein-linked DNA breaks in human camptothecin-resistant KB cell lines［J］.Cancer Res，1996，56(2):345－353

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The creation and identification of SGC-7901/HCPT cell hetero-transplanted models in nude mice

HE Yi，WANG Chong-shu△，WEI Shou-jiang，WANG Pan
(Department of General Surgery，Affiliated Hospital of North SichuanMedical College，Nanchong 637000，Sichuan，China)

Objective:To establish multi-drug resistance human gastric cancer cell hetero-transplanted models in nude mice and to explore its multi-drug resistance characteristics.Methods:Human gastric cancer cell line SGC-7901 and resistant cell lines SGC-7901/HCPT were inoculated in the left and right subcutaneous part of these nude mouse respectively reared in the SPF level of qualified animal environment.Observed transplanted tumor’growth was compared with the MTT method HCPT tumor cell sensitivity and immunohistochemical determination of the resistance gene expression in TOPO-Ⅰ.Results:SGC-7901 and SGC-7901/HCPT nude mice tumor formation rate was 100%with no self-limiting phenomenon.The growth rate showed no significant difference.Determination SGC-7901/HCPT and SGC-7901/HCPT/nude MTT，IC50 4.686 μg/mL and 4.381 μg/mL，compared with the cells before transplantation showed no significant difference，resistance gene expression by TOPO-Ⅰwas 2.964±0.162 and 2.953±0.172.The difference was not significant meaning.Conclusion:The SGC-7901/HCPT cells established in nude mice xenograft model of subcutaneous resistance had resistance remaining active and in vitro phenotype for the reversal of drug resistance mechanisms and provide a good animal model.

Stomach Neoplasm;Neoplasm Transplantation;Animals

1005-3697(2012)06-0559-03

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.010

四川省科技厅基金项目(02SC02－077)

2012-08-29

何一(1974－)，男，四川西充人，硕士，讲师，主要从事胃肠肿瘤研究。

△通讯作者:王崇树，E-mail:sichuanheyi@126.com网络出版时间:2012-11-1217∶11

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1711.016.html