分泌性蛋白hk10在眼睑基底细胞癌中的表达

王大庆，罗清礼

(1.川北医学院附属医院眼科，四川 南充 637000;2.四川大学华西医院眼科，四川 成都 610000)

分泌性蛋白hk10在眼睑基底细胞癌中的表达

王大庆1，罗清礼2

(1.川北医学院附属医院眼科，四川 南充 637000;2.四川大学华西医院眼科，四川 成都 610000)

目的:研究在眼睑基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)中NES1基因的分泌蛋白(human kallikrein 10，hk10)的表达情况，并分析其表达与表型之间的关系，从蛋白水平上研究NES1在BCC的发生发展过程中的作用。方法:采用免疫组化的方法检测hk10在31例眼睑BCC中表达情况，并分析其表达与表型之间的关系，采用Image-Pro Plus5.0图像分析系统对免疫组化结果进行扫描，定量分析hk10在不同组眼睑BCC中的表达。结果:免疫组化结果显示hk10主要表达在细胞浆中，呈棕黄色。在正常眼睑上皮组织中，hk10主要分布在上皮各层的鳞状上皮细胞胞浆中，靠近基底细胞层表达稍强;BCC原发组与BCC复发组在平均光密度上无显著性差异(P＞0.05)，在累积光密度(IOD)上，二者的差异具有统计学意义，BCC原发组具有较强的表达。结论:hk10在正常眼睑上皮组织中高表达，在眼睑基底细胞癌(BCC)中，hk10明显表达下调;NES1阳性表达细胞的减少，可能在眼睑BCC的复发中起一定作用;NES1作为一种新的抑癌基因，其可以作为眼睑BCC的肿瘤分子标记。【关键词】NES1基因;抑癌基因;眼睑基底细胞癌;分泌性蛋白hk10

基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)是一种眼睑最常见的恶性肿瘤，通常发生于暴露日光的皮肤，占所有眼睑恶性上皮性肿瘤的80%～90%，近年来随着人口的高龄化，BCC有逐渐增多的趋势［1］。因此对BCC发病机制和治疗的研究，一直是生物医学研究的重点。BCC的病因至今尚不明了。其诱发因素与日光、紫外线、放射线、砷剂及遗传等因素有关［2］。最近国外学者在研究乳腺癌和其他上皮性肿瘤中，发现了一种新的抑癌基因——正常上皮细胞特异性-1(normal epithelial cell specific-1，NES1)基因，又名激肽释放酶10(KLK10)，是人类激肽释放酶基因家族成员之一。其编码蛋白序列与丝氨酸蛋白酶高度同源，在调控正常上皮细胞生长、分化等方面中起一定作用［3］。研究发现，NES1在许多上皮性肿瘤中表达缺失或下调，与多种肿瘤的发生有关，并发现甲基化是造成其表达缺失和下调的原因。我们采用免疫组化的方法检测同属上皮性肿瘤的眼睑基底细胞癌(BCC)中NES1分泌蛋白hk10的表达情况，以期判断NES1基因在眼睑BCC中的表达情况并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 实验标本

1.1.1 临床资料收集了从2000至2005年间于华西医院眼科住院部行眼睑基底细胞癌手术切除的住院病人共31例，其中男性16例，女性15例，年龄21～79岁，平均53.11±0.85岁;右眼11例，左眼20例，上睑8例，下睑23例。

1.1.2 实验分组实验组(眼睑BCC组):原发性BCC组(26例)和复发性BCC组(5例)。正常对照组:20例意外死亡后健康人的眼睑上皮组织或距肿瘤边界1 cm的正常皮肤组织。正常阳性对照组:由于文献显示NES1在腺上皮中高表达，我们收到12例正常泪腺组织作为正常阳性对照，以观察NES1分泌的hk10在正常眼睑上皮中的表达强度。

1.1.3 手术方式及组织处理冰冻切片显微控制切除法或根据肿瘤的临床分型距离肿瘤边界3～5 mm常规切除肿瘤组织。标本一式两份，一份送常规病理检查，一份置于冻存管内，液氮速冻并于－80℃保存待用。所有病理切片均由两位经验丰富的眼科病理专家联合判读。

1.2 主要试剂与仪器

羊抗人KLK10多克隆抗体(1∶400稀释，Santa Cruz Biotechnology，美国)，抗羊S-P试剂盒，TE2000-U荧光相差倒置显微镜及显微操作系统(Nikon公司，日本)，OLYMPUS DP70正置显微镜(Olympus公司，日本)，Image-Pro Plus5.0图像分析软件(Media Cybernetics公司，美国)，ZD-9556水平摇床，C5325切片机(Shan Don公司，德国)，PHY-Ⅲ型病理组织漂烘处理仪(苏州中威电子仪器厂，中国)。

1.3 实验方法

将石蜡包埋的正常表皮及肿瘤组织块切取石蜡切片，采用链亲合素(streptavidin，SP)法行免疫组织化学检查，切片室温下放置10 min，然后放37℃孵箱10 min，常规二甲苯脱蜡10 min×2，100%－100%－95%－80%梯度酒精脱水1 min，蒸馏水洗涤3 min×3，3%H2O2阻断过氧化物酶，室温孵育20 min，PBS充分洗涤3 min×3，微波行抗原修复处理，700 W，95℃，15 min，自然冷却后PBS洗涤5 min×2，正常羊血清1∶20稀释，覆盖组织切片，37℃孵育20 min，滤纸吸去羊血清，直接加一抗(KLK10 1∶400)，37℃孵育20 min，4℃冰箱过夜，PBS充分洗涤5 min×2，滴加生物素标定的抗羊二抗1∶200稀释，100 μL，37℃孵育40 min，滴加SP 1∶200稀释，100 μL，37℃孵育30 min，滴加新鲜配制的DAB显色液，室温下5～10 min，显微镜下观察，呈棕黄色颗粒，显色适中，终止显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染3 min，室温约4～5 min，反蓝15 min，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。常规以PBS代替一抗做阴性对照。

1.4 结果判断和图像处理

免疫组织化学染色切片用Image-Pro Plus5.0图像分析系统进行扫描，每张切片随机选取5个高倍镜视野(20×10)，分别记录目标阳性细胞染色反应强度的IOD值(integrated optical density，累积光密度)和平均光密度值density(mean)，并算出它们的平均值，得到每个切片的IOD值和平均光密度值，最后把所有切片的光密度值分组归类，并作统计分析。以阳性细胞数＞5%为阳性表达。IOD值和density(mean)值与组织染色强度成正比。IOD=density(mean)×Area。

1.5 统计学分析

数据处理采用SPSS12.0统计分析软件。采用t检验来分析各实验组与对照组的光密度值，根据光密度值的大小来判断hk10表达的强弱。设定P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 hk10免疫组化检查结果

采用SP法，DAB染色，结果发现，NES1的分泌性表达蛋白hk10主要表达在细胞浆中，呈棕黄色。在正常眼睑上皮组织中，我们可以看到hk10主要分布在上皮各层的鳞状上皮细胞胞浆中，靠近基底细胞层表达稍强(图1，图2)，而在正常泪腺组织中，其高表达于导管和腺泡小叶的立方柱状上皮细胞胞浆中，在导管中也可见其分泌的hk10表达(图3，图4)。在BCC各组中，hk10明显表达下降(图5～图14)。

2.2 免疫组化表达结果的统计分析

2.2.1 定性分析20例正常眼睑上皮组织和12例正常泪腺组织(正常阳性对照组)中均检测到hk10的阳性表达。31例BCC中有18例检测到hk10阳性表达，有13例hk10表达阴性或呈极弱阳性。

2.2.2 定量分析采用Image-Pro Plus5.0图像分析系统进行扫描，每张切片随机选取5个高倍镜视野(20×10)，分别记录目标阳性细胞染色反应强度的IOD值和平均光密度值，并算出它们的平均值，得到每个切片的IOD值和平均光密度值，最后把所有切片的光密度值分组归类，并作统计分析，得到如下几组数据(表1):可以看到BCC组与正常对照组比较，表达下降，其差异具有统计学意义(P＜0.01)。正常对照组与正常阳性对照组的表达差异也具有统计学意义(P＜0.01)，正常阳性对照组的表达更强。BCC原发组与BCC复发组在平均光密度上无显著性差异(P＞0.05)，在累积光密度(IOD)上，二者的差异具有统计学意义，BCC原发组具有较强的表达。

表1 实验组与对照组免疫组化染色的光密度值比较(x－±s)

3 讨论

正常上皮细胞特异性-1基因(normal epithelial cell specific-1，NES1)，是人类激肽释放酶基因家族的成员之一。基因长约5.5 kb，位于染色体19q13.3，有6个外显子和5个内含子［4］。NES1编码276个氨基酸，分子量约为30.14 kD，其蛋白序列类似于丝氨酸蛋白酶，是一种分泌蛋白，由于其基因产物序列与人类激肽释放酶家族的其它成员和PSA(前列腺特异抗原)有着50～60%的同源性和34%～42%同一性，它又位于19号染色体q 13.3激肽释放酶位点内，因此，NES1又被命名为激肽释放酶10(Kallikrein 10)。尽管与己知的丝氨酸蛋白酶序列有着高度的相似，但大量生化实验显示NES1不具有蛋白酶功能，而具有潜在的分化功能，可能与NES1氨基酸末端不同寻常的结构有关，通常大多数有活性的丝氨酸蛋白酶的末端氨基酸为盐桥形成所必需的IVGG序列，而研究发现NES1氨基酸末端序列为LDPEAY［5］。NES1的mRNA在许多组织器官中都有表达，特别是带腺体的上皮细胞是其表达的主要位点。2002年，Petraki等［6］通过免疫组化方法发现，NES1的表达通常在细胞浆，并且非器官特异性，其中代表性的器官有:乳腺、前列腺、卵巢、肾脏、睾丸、附睾、子宫内膜、输卵管、胃肠道、气管、唾液腺、胆道、胆囊。脉络膜丛上皮、周围神经和一些神经内分泌器官弥漫性地强表达这种蛋白。

NES1作为一种新的抑癌基因，其在肿瘤发生发展中的作用越来越引起人们的重视，国外在乳腺癌和其他一些生殖腺肿瘤中的研究显示，NES1的mRNA和表达蛋白在许多肿瘤中表达下降或缺失，其表达产物对肿瘤患者的早期诊断、估计预后等方面具有重要作用。Dhar等［7］采用原位杂交的方法检测了136例不同乳腺组织样本中NES1mRNA的表达情况，研究发现在全部30例正常乳腺组织和36例(75%)乳腺导管典型和不典型增生样本中NES 1均呈高表达;其余12例(25%)乳腺导管典型和不典型增生样本中NES1表达降低;28例导管原位癌样本中13例(46%)NES1表达缺失，其余15例(54%)NES1表达降低;而29例(97%)浸润性导管癌样本NES1表达缺失，仅1例(3%)NES1呈弱表达。因此认为，NES1mRNA在正常乳腺组织和良性病变中正常表达，在乳腺肿瘤的发生、发展过程中NES1表达缺失，并且NES1的表达可作为乳腺癌进展研究中的一个分子标志物。为探讨NES1基因的表达缺失是否可作为乳腺癌发病中的一个早期指标，Yunes等［8］采用原位杂交方法研究了29例在诊断性活检中确诊为导管原位癌的样本中NESl mRNA的表达与这些病例在行进一步手术后的病理诊断之间的关系。结果6例活检组织中有NES1表达的患者无1例最终被诊断为浸润性导管癌，而在NES1表达缺失的病例中有40%的患者最终被发现为浸润性导管癌，并且在NES1表达缺失，组织学分级为低-中分化的导管原位癌组中83%的病例被诊断为浸润性导管癌，而在高分化组，仅24%的病例为浸润性导管癌。结果提示，在导管原位癌病例中NES1表达缺失预示着浸润性导管癌的高危性，NES1表达的预测价值与低-中分化导管原位癌相关性更强。Goyal等［5］研究显示NES1 mRNA及其表达蛋白在大多数乳腺癌细胞中表达明显降低或完全缺失，将NES1基因转染到恶性程度高的乳腺癌细胞株MDA-MB-231中后，可降低其恶性表型，将经NES1转染后的MDA-MB-231细胞接种至裸鼠体内，观察到肿瘤生长被抑制了。因而提示，NES1基因可作为一种肿瘤抑制基因和分子标志物，其表达失活可能与乳腺癌的发生、发展有关。文献显示在卵巢癌、睾丸癌和前列腺癌中也有相似情况［9－11］。

我们的研究显示，20例正常眼睑和12例正常泪腺组织中hk10强表达，并主要表达在细胞浆中，呈棕黄色。在正常眼睑上皮组织中，我们可以看到hk10主要分布在上皮各层的鳞状上皮细胞胞浆中，靠近基底细胞层表达稍强(图2)，而在正常泪腺组织中，其高表达于导管和腺泡小叶的立方柱状上皮细胞胞浆中，在导管中也可见其分泌的hk10表达(图4)。在正常眼睑上皮组织中hk10表达强度与正常泪腺组织相比相对较弱，正常泪腺的IOD值和平均光密度值都比正常眼睑上皮组织高，这也再次证实了腺上皮是其高表达位点，与文献报道相符［6］。

在31例眼睑BCC中有18例检测到hk10阳性表达，有13例hk10表达阴性或呈极弱阳性。BCC组与正常对照组比较，表达下降，其差异具有统计学意义(P＜0.01)(表1)。为了研究NES1表达与预后的关系，我们设立了BCC原发组和BCC复发组，免疫组化显示二者在累积光密度(IOD)上有显著差异(P＜0.01)，原发组明显高于复发组。在平均光密度上二者无显著性差异(P＞0.05)。这说明在单个阳性细胞的表达上二者无差异，但原发组有更多表达hk10的阳性细胞。这提示我们BCC的复发可能与NES1阳性表达细胞的减少有着密切的关系。

NES1基因在眼睑BCC中表达的明显下调，说明作为一种新的抑癌基因，NES1可以作为一种分子标记，其与眼睑BCC的发生发展有着密切的关系，但能否作为一种早期诊断和预后的指标，我们的样本量还相对较少，要得到更有意义的结果，还需扩大样本，做更多的实验来证实。

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The study of human kallikrein 10 expession in eyelid basal cell carcinoma

WANG Da-qing1，LUO Qing-li2
(1.The Department of Ophthalmology of the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000;2.The Department of Ophthalmology of Huaxi Hospital of Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China)

Objective:To investigate the expression of human kallikrein 10 in eyelid basal cell carcinoma(BCC)，and analyze the correlation between its expression and the tumorigenic phenotype.In addition，to study the role of NES1 in oncogenesis and progression of eyelid basal cell carcinoma at the protein level.MethodsThe Study involved the expression of human kallikrein 10 in 31 cases of eyelid basal cell carcinoma by immuno－histochemistry and analyzed the correlation between its expression and the tumorigenic phenotype at the protein level.Qquantificational analysis of the expression of hk10 in different groups was done by using Image-Pro Plus5.0 softwear.Results:The immuno histochemistry showed that the expression of hk10 is generally cytoplasmic.In normal eyelid skin，it expresses widely in the cytoplasmic of leprose epithelia.Near the basal cell，it expresses more intensely.It has no differentiation between the primary group and recurrence group in density(P＞0.05)，but in integrated optical density(IOD)，the differentiation has a statistical significance(P＜0.01).Conclusionhk10 has a higher expression in normal eyelid skin，but hk10 expression has a obviously decline in eyelid BCC.The positive expression cell decline maybe play a role in the recurrence of eyelid BCC.NES1 maybe serves as a novel tumor suppressor gene and molecular biomarker in eyelid BCC.

NES1 gene;Tumor suppressor gene;Eyelid BCC;Human kallikrein 10

1005-3697(2012)06-0571-06

R773.4

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.013

四川省教育厅基金(07ZC021)

2012-07-10

王大庆(1969－)，男，四川广安人，副教授，博士，主要从事眼眶及眼表疾病的研究。E－mail:wdq11@sina.com

时间:2012-11-1217∶08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1708.012.html

(学术编辑:兰长骏)