高效液相色谱法快速测定脑梗塞模型大鼠脑组织中多胺的含量

何颖娜，尚京川，杨志强

(1.河北医科大学中医学院，河北 石家庄 050091;2.重庆医科大学药物化学和生物材料研究室，重庆 400016;3.河北瑞洲生物科技有限公司，河北 石家庄 050021)

高效液相色谱法快速测定脑梗塞模型大鼠脑组织中多胺的含量

何颖娜1，尚京川2△，杨志强*

(1.河北医科大学中医学院，河北 石家庄 050091;2.重庆医科大学药物化学和生物材料研究室，重庆 400016;3.河北瑞洲生物科技有限公司，河北 石家庄 050021)

目的:建立一种简便、灵敏和快速分离测定大鼠脑组织中腐胺、精脒和精胺等多胺含量的高效液相色谱法。方法:采用苯甲酰氯作为衍生化试剂，以1，6-己二胺为内标，采用polygocyl(250×4.6 mm 5 μm)C18色谱柱，流动相为甲醇-水(62:38 V/V)，流速1.0 mL/min，检测波长229 nm。结果:本法线性范围是1～2 000/mL，回收率大于90%。日内和日间变异系数为1.5%～4.2%。最低定量浓度为1 nmol/mL。结论:该方法符合生物样品分析要求，为脑组织中多胺的含量测定提供了一种简便、准确、灵敏度高的分析方法。

多胺;高效液相色谱;固相萃取

多胺(polyamines)是指以腐胺(putrescine)、精胺(spermine)和精眯(spermidine)为代表的多个氨基的生物原物质。多胺做为体内促进细胞生长的重要物质之一，对细胞的生长、增殖及组织的再生起着关键性作用。在多种病理情况下(如肿瘤、脑损伤等)，多胺的代谢可发生明显的紊乱。近年来的研究表明:脑组织的中多胺代谢的紊乱与多种脑损伤有密切关系，且损伤的程度不同变化不一，因此可以作为脑损伤严重程度的敏感指标［1］。为了探讨脑梗塞后脑组织中多胺的含量变化，本文提出一种简便、灵敏、快速的多胺检测方法，用于大鼠脑组织中多胺含量的测定，获得满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料

美国Angilent 1100高效液相色谱仪，UV 1100紫外检测器，Model TJ-R离心机(美国贝克曼公司)，QL-901漩涡混匀器(江苏海门市琪琳医用仪器厂)，固相萃取仪(美国安捷伦公司)，Bond-Elut C18固相萃取小柱(美国安捷伦公司)。腐胺、精胺和精眯对照品(瑞士FluKa公司纯度99.9%)、1，6-己二胺(色谱纯)、苯甲酰氯(分析纯)、甲醇(色谱纯，美国天地公司)其余试剂均为分析纯。

样品收集方法:健康雄性Wistar大鼠40只，体重180～220 g(由重庆医科大学实验动物中心提供)，随机分为对照组和脑梗塞组，脑梗塞组采用光化学诱导法制备大鼠局灶性脑梗塞模型。然后分别于梗塞后5 min、8 h、和24 h，将大鼠迅速断头处死，取梗塞周围脑组织约100 mg，液氮中保存，待检。对照组除不经过光照处理造成脑梗塞之外，其他处理同脑梗塞组。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制对照品溶液:精密称取腐胺、精眯、精胺对照品8.8、14.7、20.2 mg(分别相当于腐胺、精眯、精胺100 mmol)，置100 mL量瓶中，以5%HClO4溶解并定容，得1.0 mmol/mL的多胺对照品溶液。

对照品工作液:依次用5%HClO4稀释制成1、3、10、30、100、500、2 000 nmol/mL的多胺系列浓度对照品溶液。

内标溶液:精密称取1，6-己二胺对照品25.0 mg，置25 mL量瓶中，以5%HClO4溶解并定容，得1.0 mg/mL的内标溶液

内标工作液:再用5%HClO4稀释成50 μg/mL的内标工作液。

1.2.2 组织样品预处理取出液氮保存的脑组织，准确称量0.5 g，加入内标溶液10 μL和5%HClO45 mL，冰浴下匀浆(3 000 r/min)1 min，离心(13 000 r/min 4℃)10 min，顷出上清液，沉淀部分加入等量5%HClO4，混匀后，离心(13 000 r/min 4℃)10 min，合并两次提取液，加入等体积2.5 mol/LNaOH，待衍生。

1.2.3 衍生化反应和固相萃取在待衍生溶液中加入苯甲酰氯7 μL，涡旋混匀，40℃水浴中反应30 min，然后用6 mol/L HCl调节pH值为7左右，加在C18固相萃取柱(预先用甲醇3 mL活化，3 mL水平衡)上，依次用15 mL双蒸水、15 mL 15%甲醇和1 mL苯冲洗小柱，洗去极性杂质，抽干，以0.5 mL甲醇洗脱待测组分，混匀后取100 μL进行HPLC分析，以内标法定量。

1.2.4 色谱条件色谱柱:polygocyl C18(250×4.6 mm 5μm)(大连色谱中心填装);流动相:甲醇-水(62:38 V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长:229 nm;柱温:25℃。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 多胺的色谱分离

多胺的标准品和样品按方法处理项操作，色谱图见图1，在此色谱条件下多胺分离较好，在线扫描显示标准多胺和样品多胺衍生物的紫外吸收光谱一致，最大吸收波长(λ max)为229 nm，以此为检测波长。

2.2 标准曲线、回收率及精密度

2.2.1 标准曲线取系列腐胺、精眯、精胺对照品溶液，按“样品处理方法”项下操作，以多胺的峰高和内标峰高之比(Hi/Hs)为横坐标，以多胺的浓度(C)为纵坐标，用加权最小二乘法(1/c2)进行回归，得到腐胺、精眯、精胺的回归方程分别为:

腐胺:C1=0.03129+4.496 Hi1/Hs1r=0.9955;(n=6)

精眯:C2=0.04789+4.591 Hi2/Hs2r=0.9996;(n=6)

精胺:C3=0.02321+5.495 Hi3/Hs3r=0.9993;(n=6)

结果表明:多胺的浓度在1～2 000 nmol/mL之间，C与Hi/Hs之间线性关系良好，最低定量限为1 nmol/mL。

2.2.2 回收率和精密度取多胺对照品溶液，加入内标溶液，按“样品处理方法”项下操作，根据峰高比计算多胺在脑组织中的回收率，测得回归率分别为:腐胺96.47%，精眯95.39%，精胺92.11%(n=6)。

日内误差和日间误差按回收率方法，对每个脑组织样品分别在日内各做5次，并在连续5d内分别各做一次，测得日内和日间精密度的变异系数在1.5%～4.2%之间。

2.3 大鼠脑组织中多胺的含量比较

采用本方法对和脑梗塞模型大鼠脑组织中多胺的含量进行测定(表1)，结果表明:与对照组相比，梗塞后8 h和24 h大鼠脑组织中腐胺的含量明显增高(P＜0.05)，并且随着时间的延长，脑组织中多胺的含量有逐渐增高的趋势;而精胺和精眯的含量虽然有较大程度的增高，但大多数没有显著性差异。

表1 大鼠脑组织多胺的含量(±snmol/g)

表1 大鼠脑组织多胺的含量(±snmol/g)

*:P＜0.05，与对照组相比。

对照组 29.39±3.14571.49±231.21359.12±130.06梗塞5 min943.98±11.09*1 867.02±798.251 120.74±377.4*梗塞8 h1056.97±16.85*1 107.92±577.50919.13±571.52梗塞24 h9337.09±79.74*6 1 064.66±576.631 031.18±434.38

3 讨论

脑组织中生化的改变是反映神经损伤的敏感指标。其发生在损伤的早期和神经组织发生形态学改变之前。生化改变是神经系统功能紊乱的基础。精眯在体内具有广泛的生物学调控作用，促进细胞分化、增殖、生长、稳定细胞和亚细胞器结构、调控体内核酸、蛋白质的生物合成、修饰蛋白激酶等，是评价脑组织发育的有用指标。在动物和人体内鸟氨酸经脱羧酶作用生成腐胺，腐胺再进一步转化生成精眯、精胺等。成年动物脑中多胺的合成，在多种病理情况下会明显增加，尤其是在不同的病理阶段，多胺的合成对不同脑受损的应激状态这种敏感性，可作为脑损伤严重程度的敏感指标［2－3］。本实验的研究显示，缺血后脑组织中的腐胺含量明显增加，并且随着缺血时间的延长，含量成倍增长，提示腐胺的含量变化与缺血时间密切相关，而精胺和精眯的变化却不显著。

多胺的测定方法可分成化学法和生物法两类。虽然酶法和免疫法已有报道，但这些方法至今尚未完善。HPLC法具有分析速度快、检测灵敏度高、定量分析准确的特点，是目前临床疾病中多胺含量分析测定的主要手段。其中，反相高效液相色谱(RPHPLC)法被多数研究者选择用于多胺的分离和定量分析。多胺在可见和紫外区域既没有满意的吸收，也没有荧光成分，所以在采用HPLC测定时，一般需要对多胺进行化学衍化处理。根据其所用检测器的不同，可以将多胺的测定方法分为紫外检测法，荧光检测法以及电化学检测法，荧光检测法及电化学检测法的灵敏度较紫外法高，但是荧光检测法和电化学检测法衍生反应较慢，一般需要梯度洗脱，流动相消耗较大且时间很长，一般在40 min以上［4］，而紫外检测法则具有衍生反应迅速、衍生产物稳定且使用等度洗脱、所用时间短等优点，因此适用于多胺的快速测定。

本方法以苯甲酰氯作为衍生试剂，衍生反应快速、稳定，采用等度洗脱、紫外检测。方法稳定性好，分析时间在20 min内，与荧光检测或者电化学检测法相比，分析时间大大缩短。

实验过程中采取直接称取脑组织，加入内标，然后进行匀浆的处理方法，不仅缩短前处理时间，还避免反复冻融脑组织样品对多胺含量的影响，保证结果的准确性脑组织样品经低温匀浆后，进行衍生化反应，然后经固相萃取，除去杂质，即可进行HPLC测定，前处理方法简便、快速，而且可以批量处理样品，满足脑组织中多胺快速测定的要求。

［1］Kim GH，Komotar RJ，McCullough-Hicks ME，et al.The role of polyamine metabolism in neuronal injury following cerebral ischemia［J］.Can J Neurol Sci，2009，36(1):14－19

［2］Li J，Doyle KM，Tatlisumak T.Polyamines in the brain:distribution，biological interactions，and their potential therapeutic role in brain ischaemia［J］.Curr Med Chem，2007，14(17):1807－1813

［3］Takano K，Ogura M，Nakamura Y，et al.Neuronal and glial responses to polyamines in the ischemic brain［J］.Curr Neurovasc Res，2005，2(3):213－223

［4］Fu S，Xiao C，Zhao W，et al.Polyamines analysis by HPLC and their application as tumor markers［J］.Front Biosci(Elite Ed)，2012，(4):1795－1801

Rapid high performance liquid chromatography assay of polyamines in rat brains

HE Ying-na1，SHANG Jing-chuan2△，YANG Zhi-qiang3
(1.Traditional Chinese Medical College，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，Hebei;2.Research Institute of Pharmic Chemistry and Biomaterials，Chongqing university of Medical Science，Chongqing 400016，Chongqing;3.Hebei Natural Co.Ltd.Shijiazhuang 050021，Hebei，China)

Objective:To develop a simple，sensitive and fast method for determination of putrescine，spermidine and spermine in mouse rat brains.MethodsWith the benzoyl chlorides as the derivation reagent and 1，6-Hexanediamine as the internal standard，the polyamines were separated on the polygocyl C18(250×4.6 mm 5μm)column using methanol-water(62:38 V/V)as the mobile phase(flow rate 1.0 mL/min)with UV detector at wavelength 229 nm.Results:The standard curve was linear in the content range 1－2000 nmol·mL－1.The recoveries were higher than 90%and the RSD was in the range from 1.5%to 4.2%.The low limits of quantification were one nmol/mL.Conclusion:The proposed method was suitable for screening polyamines in rat brains.

Polyamines;High performance liquid chromatography(HPLC);Solid-phase extraction(SPE)

1005-3697(2012)06-0538-04

R741

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.004

河北科技支撑计划资助项目(11230908D-4-2)

2012-08-20

何颖娜(1977－)，女，医学博士，讲师，主要从事药物代谢动力学研究。

△通讯作者:尚京川，E-mail:heyingna2002@163.com网络出版时间:2012-11-1217∶14

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20121112.1714.020.html