水飞蓟宾对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能及对神经细胞内活性氧的影响

毕鹏翔，张忠敏，周小莉，郭艳芹

(1．牡丹江医学院 附属红旗医院 神经内科，黑龙江 牡丹江 157011;2．宁夏医科大学 附属心脑血管医院，宁夏 银川 750004)

水飞蓟宾对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能及对神经细胞内活性氧的影响

毕鹏翔1，张忠敏1，周小莉2，郭艳芹1

(1．牡丹江医学院 附属红旗医院 神经内科，黑龙江 牡丹江 157011;2．宁夏医科大学 附属心脑血管医院，宁夏 银川 750004)

目的 探讨水飞蓟宾对阿尔茨海默病(AD)大鼠行为的改善作用及对神经细胞内自由基的清除情况。方法 大鼠60只，采用皮下注射东莨菪碱致AD模型，随机分为模型组、空白对照组、水飞蓟宾高中低剂量组及阳性对照多奈哌齐组，用Morris水迷宫法，检测大鼠的学习记忆能力。另外采用过氧化试剂诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)过氧化损伤通过流式细胞仪检测水飞蓟宾对活性氧自由基的清除能力。结果 模型组与空白对照组比学习记忆能力显著下降，治疗组与模型组比学习记忆能力得到显著改善，同时体外实验证实水飞蓟宾能显著降低细胞内的自由基水平。结论 水飞蓟宾对AD有较好的改善作用，其机制可能与其抗自由基活性有关。

水飞蓟宾;阿尔茨海默病;水迷宫;自由基

随着社会的发展，人口老龄化的加剧，阿尔茨海默病(Alzheimer'Disease，AD)的患病率和发病率呈指数上升。AD是一种神经退行性疾病［1］，神经元进行性的退化，丧失功能并死亡，被AD破坏的大脑随着疾病破坏神经组织，其体积和重量都会缩小。其显著特征是严重的记忆丧失和个性改变，患者生活不能自理，寿命明显缩短［2］。本研究通过水飞蓟宾对 AD大鼠模型的干预，及对神经细胞(SHSY5Y)的作用，探讨水飞蓟宾对 AD大鼠及 SHSY5Y 内自由基的影响［3］。

1 材料

SH-SY5Y细胞，American Type Culture Collection，ATCC，Rockville，MD，USA。

东莨菪碱，成都瑞芬思生物科技有限公司;水飞蓟宾，天津天士力制药股份有限公司;多奈哌齐，天津力生制药股份有限公司。

胎牛血清，杭州四季青公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，Sigma公司;RPMI 1640培养基，Gibco公司。

MCO-15AC二氧化碳培养箱，三洋公司;KQ-500DE超声波清洗器，昆山市超声仪器公司;IX70-142倒置式生物显微镜，日本奥林巴斯;Morris水迷宫分析系统，上海欣欣信息科技有限公司;流式细胞仪，美国BD公司。

健康雄性Wistar大鼠60只，体重(200±20)g，由牡丹江医学院动物中心提供，实验动物合格证号:SCXK(黑)2006-010。

2 方法

2．1 动物分组及给药

随机分为6组，每组10只。空白对照组皮下注射生理盐水;模型组皮下注射东莨菪碱0．4 mg/kg;水飞蓟宾高中低剂量组(100，200，400 mg/kg)口服给药2 h后给予东莨菪碱［4］;阳性对照组皮下注射多奈哌齐1．2 mg/kg，30 min后给予东莨菪碱。各组动物30 min后进行Morris水迷宫检测。

2．2 AD大鼠学习记忆功能测定

应用Morris水迷宫法［5］。实验于造模前训练2 d，动物每天4次下水训练、造模后给药后连续3 d实验动物同样每天下水4次，每次分别从池壁4个不同起始点将大鼠面向池壁放入水池，记录每次找到平台的时间即为逃避潜伏期，记录动物的潜伏期。第5天实验撤掉站台检测动物穿越站台区域的次数［6］。

2．3 细胞培养及药物处理

SH-SY5Y细胞接种在含5%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃，5%CO2培养箱中培养。分为空白组;模型组给予过氧化叔丁基醇(tBHP)500 μmol;水飞蓟宾组在给予tBHP 1 h后给予水飞蓟宾 15 μmol，12 h 后 DCFH-DA(2，7，-dihydro-dichloro fluorescein diacetate)染色30 min，形态学观察及流式细胞仪检测活性氧(ROS)的水平［7］。

3 结果

3．1 大鼠行为能力

各组大鼠在Morris水迷宫中定向航行试验模型组与空白组相比动物的潜伏期显著增加，模型组的大鼠丧失学习记忆能力，平均逃避潜伏期改变不大。而给予水飞蓟宾的AD大鼠，平均逃避潜伏期时间明显缩短(P＜0．05)。说明经过水飞蓟宾治疗的AD大鼠，空间记忆学习能力明显提高，见表1。

3．2 空间探索试验

拆去水下平台后，以原站台位置(第3象限)的动物穿梭次数为指标，模型组在第3象限穿越站台次数明显降低，而给予高剂量水飞蓟宾治疗的AD大鼠则显著增加，与阳性对照组相当。见表1。

3．3 流式细胞术检测SH-SY5Y细胞产生ROS

tBHP可以诱导SH-SY5Y细胞ROS的产生，水飞蓟宾组ROS的产生量显著降低。见图1。模型组的ROS阳性细胞为(19．83±1．68)%，明显高于对照组的(3．03 ±0．32)%(P ＜0．01);水飞蓟宾组为(7．77 ±0．40)%，明显低于模型组(P ＜0．01)。

表1 大鼠在Morris水迷宫中逃避潜伏期穿越站台次数(n=10，x±s)

图1 流式细胞术检测仪检测ROS的结果

4 讨论

本研究显示，造模后模型组大鼠认知能力较空白对照组明显下降;治疗后，各给药组与模型组比较认知能力明显改善，表明水飞蓟宾可改善AD大鼠的学习记忆能力。

SH-SY5Y源于SH-N-SH的神经瘤型亚系，被广泛应用于神经系统疾病的发病机制和防止措施的研究中。自由基代谢异常是AD等神经退行性疾病发生发展的主要机理之一。

ROS诱导的神经细胞损伤参与了一系列的神经病理学过程，包括脑缺血，神经退行性疾病等。水飞蓟宾能通过消除氧自由基，抑制脂质过氧化及5-脂氧酶活性来降低被损伤脑组织中丙二醛及白三烯含量，升高超氧化歧化酶含量。本实验给予药物干预后ROS水平明显下降。

本研究提示，黄酮类化合物水飞蓟宾对AD大鼠的脑神经细胞具有保护作用，可能是通过清除细胞内过多的自由基，降低细胞的应激反应而实现的，从而改善AD大鼠的学习记忆能力，对AD的防治和改善具有现实意义，但具体机制有待进一步研究。

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The impact of silibinin on learning and memory in rats with Alzheimer's and the reactive of oxygen in nerve cells

BI Peng-xiang1，ZHANG Zhong-min1，ZHOU Xiao-li2，GUO Yan-qin1
(1．Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China;2．The Cerebrovascular Hospital Affilated to Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China)

Purpose To investigate the protecting effects of silibinin on the behavior of Alzheimer's(AD)rats and on tert-Butylhydroperoxide(tBHP)-induced reactive oxygen species(ROS)in neuroblastoma cells(SH-SY5Y)．Methods 60 rats modeled with injection of scopolamine were randomly divided into model group，control group，silibinin(high-mid-low dose)groups，and the positive control group with donepezil treatment．The ability of learning and memory was appraised by water maze test．SH-SY5Y cells peroxidation damage was induced by peroxide reagent and eliminating effects of ROS were in valued by flow cytometry．Results Compared with control group，the learning and memory ability of scopolamine group was much declined，but it became much better in silibinin treatment group．Besides，experiments in vitro confirmed that silibinin could reduce the intracellular level of free radical significantly．Conclusion-Silibinin plays an important role in improvement of AD and the mechanism may attribute to with its antifree radical activity．

silibinin;Alzheimer's disease;water maze;ROS

R285．5

A

1005-1678(2012)06-0802-03

2012-08-02

国家自然科学基金(NO．81141080);黑龙江省自然科学基金项目(NO．D2007-100)

毕鹏翔，男，讲师，硕士;郭艳芹，女，通信作者，教授，Email:yanqinguo@sina．com。