不同温度、盐度下浒苔（Entromorphra prolifera）群体增长和生殖的显微观测＊

张晓红，王宗灵，李瑞香＊，李 艳，王 晓

（1.国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛266061；2.海洋生态环境科学与工程国家海洋局重点实验室，山东 青岛266061）

不同温度、盐度下浒苔（Entromorphra prolifera）群体增长和生殖的显微观测＊

张晓红1，2，王宗灵1，2，李瑞香1，2＊，李 艳1，2，王 晓1，2

（1.国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛266061；2.海洋生态环境科学与工程国家海洋局重点实验室，山东 青岛266061）

为研究温度、盐度对浒苔（Entromorphraprolifera）群体增长和生殖的影响，在实验室内设10个温度梯度、每个温度下又设4个盐度梯度，比较了不同培养条件下藻体的湿重、特定生长率（SGR）。浒苔生长对温度的变化较盐度的变化为敏感。在同一盐度下，浒苔SGR随温度的增加呈先升高后降低的趋势。随着盐度的降低，最适生长温度有升高的趋势。20℃、S为26时浒苔SGR最高，达37.80%。SGR高的实验组最先进入生殖生长期，随之，SGR骤降，藻体形态也发生的变化。通过对这一变化过程的观测研究加深对绿潮暴发及演化过程的理解。

浒苔；特定生长率；营养生长；生殖生长

（高 峻 编辑）

自2007年以来，我国黄海连续暴发大规模的浒苔（Entromorphraprolifera）绿潮，其规模、覆盖范围、持续时间和对环境的影响程度属世界罕见。尤其是2008年，青岛近岸海域在2008－06中旬涌现大规模浒苔绿潮，2008－06底最大影响面积达25 000km2，仅青岛市就打捞浒苔近80万t，造成直接经济损失13.22亿元；2009年黄海海域最大分布面积达58 000km2，此后几年黄海浒苔绿潮的影响面积都在20 000km2以上，对沿岸地区造成不同程度的经济损失［1］。浒苔生长到底有多快？其适宜的环境因子有哪些？能否根据其生长速率来预测绿潮发展态势？浒苔对温度、盐度的适宜性如何？这些都是我们的重要研究内容。

有研究表明，浒苔生长的最适宜的t为15～25℃，S为20.2～26.9［2］。孢子释放的最适宜的t为20～35℃，S为28～40，均相对较高［3］。也有学者对孢子的早期分裂和叶状体的形成进行了显微观察［4］。浒苔的大量增殖与其多种生殖方式有关，主要包括有性生殖和无性生殖及营养生殖［5］。王晓坤等［6］、林阿朋和沈颂东［5］观察到以藻段再生、原生质体（细胞）再生所代表的营养繁殖普遍存在于浒苔的各种生活史中。国外学者Hiraoka等［7］发现浒苔存在3种生活史（1种有性生活史和2种无性生活史），并阐述了3种生活史的交替。通过定量观测发现，扁浒苔（E.compressa）的大部分生殖细胞均能在短时间内附着，但也会有一些不能附着［8］。通过野外取样和室内培养的方法，证明冬季水体中孢子的存储量决定了第2年浒苔的新生个体量［9］。研究盐度、营养盐和光照对浒苔属孢子早期生长影响时发现，盐度对其影响最大，高盐度有促进作用，低盐度抑制其生长［10］。

漂流聚集的浒苔通常是以营养繁殖的方式不断进行藻体扩增［11］，而大量生殖细胞的释放又向海区内输入了更多的新个体。温度、盐度对浒苔的这2个关键阶段及其之间过渡均有较大影响。通过藻体培养和同步显微观测实验，探讨了不同温度、盐度对浒苔群体增长和生殖过程的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

浒苔藻体于2009－04采自江苏南通如东近海紫菜养殖区筏架，采集后用消毒海水冲洗，低温充气暂养带回实验室。马上选取健康、较完整的藻体用于实验。在15℃，光强100μmol·m－2·s－1驯化3d后进行试验。实验用海水取自山东青岛沙子口附近海域，沉淀过滤，高温消毒后使用。培养液为PES［6］。

1.2 培养条件

GXZ3－250D型培养箱，光强100～110μmol·m－2·s－1，光暗比12L∶12D。

10个温度梯度，分别为5℃，8℃，11℃，14℃，17℃，20℃，23℃，26℃，29℃，32℃。每个温度又设4个盐度梯度14，20，26，32。共40个温盐组合，每个组合设3个平行样。

500mL PES培养液内加入（0.50±0.01）g驯化后的藻体。培养过程中每天定时用玻璃棒搅拌水体3～5次，6d更换一次培养液。实验共进行15d。

1.3 称重方式

3d取样称重一次。捞出培养液中的藻体，抽干表面水分。抽滤装置由布氏漏斗（漏斗内铺有直径9cm的定性滤纸）、抽滤瓶和真空泵组成，泵压在0.02MPa左右。每个样品抽滤1min（预实验证明，此压力下抽滤对藻体无明显影响，抽滤1min后藻体重量基本稳定），用Mettler Toledo Pl203型10－3g电子天平称量。

1.4 数据处理

计算特定生长率（SGR）［12］：

式中，W0为藻的初始湿重（g）；Wt为试验结束时藻的湿重（g）；t为试验持续的天数。其中第1～6天的SGR用统计软件SPSS 13.0进行双因子方差分析以及Duncan多重比较，分析不同温度、盐度下浒苔SGR的差异显著性（P＜0.05）。

1.5 显微观察

取样称重时，捞出藻体，将培养水体混匀后取5mL水样，Lugol’s溶液固定［13］。使用Nikon ECLIPSE TE2000－U显微镜，观察并拍照记录水体中和藻体细胞的变化。

2 结 果

2.1 不同温度、盐度下15d内浒苔湿重及特定生长率的变化

2.1.1 藻体湿重随时间变化

S为14，15d时，32℃下的湿重最大，达5.40g，5℃温度组湿重最低，为2.46g（图1）。S为20，20℃组湿重始终最高，15d后增至5.95g，较初始量增加了近11倍；5℃组的湿重最低，15d时的湿重仅为2.68 g（图2）。S为26，20℃组的湿重明显高于其他温度组的，15d后湿重达6.02g。然而32℃湿重和14℃的相当，相对较低。S为32下，20℃组各时间点的湿重均最高，15d后湿重高达6.13g，其次23℃，29℃，17℃三个温度组的湿重较高，26℃，32℃组湿重较低，其中湿重最低的温度组是5℃（图4）。

各温度、盐度组合下浒苔湿重随培养时间呈不断增长的趋势，在实验结束时各温度、盐度梯度组的湿重较初始值都有极大的升高。从图1～4可以较明显地看出S为20～32，最适的生长温度在20℃；在S为14时，浒苔最适生长的温度较高，为29℃。随着盐度的降低，最适生长温度有升高的趋势。

同一温度不同盐度条件下的比较发现，t为32℃，S为14组的湿重最高（5.41g），S为20组次之（5.15 g），S为26组最低。t为14～29℃时各实验组均在S为32时终湿重最高，其中最高湿重为6.13g（20℃，S为32组）。5～11℃各实验组在S为14～20范围内最终湿重较高（4.00g左右）。基本呈现极高温、极低温环境下低盐度较利于浒苔生长，而在14～29℃时高盐度较利于其生长。

2.1.2 特定生长率随时间变化

4个盐度组的SGR变化趋势基本相同。在此仅列举了S为26的不同温度组15d内特定生长率（SGR）的变化（图5）。第1～3天的SGR，除5℃外，其余温度组均在25%以上。在第3～6天除14℃和17℃两组外，其余温度组的SGR均降至20%以下。第6～9天较低温组的5℃、8℃的SGR较高，分别为20.20%和15.75%，而其他温度组均在10%左右。第9～12天5℃、8℃的SGR有所下降，分别为13.59%和12.41%，其他温度组的SGR均在10%以下。第12～15天各组的SGR均在10%以下，但5℃、8℃的SGR仍相对较高（8.45%左右），32℃组的SGR已降至1.25%。

因为4个盐度组的SGR变化趋势基本相同，故分为14～32℃温度组和5～11℃温度组讨论。14～32℃组在第1～3天时SGR最高，第1～3天时SGR骤降，第6～15天SGR均较低且变化趋势较缓；5～11℃组的SGR呈先降低后升高再降低的趋势。第1～6天14～32℃温度组的SGR明显高于5～11℃组，第6～15天后者SGR高于前者的。

图5 S为26时下不同温度梯度藻体的特定生长率随培养时间的变化Fig.5 Changes of specific growth rate（SGR）for E.proliferaat different temperatures and 26salinity during culture time

2.2 不同温度、盐度下特定生长率（SGR）比较

对藻体及培养水体的显微观测表明，约培养第6天前后藻体陆续进入生殖生长阶段，很多实验组SGR骤降。在比较温度、盐度对生长率的影响时，为避免生殖生长的影响，仅对前6天的SGR数据进行方差分析和Duncan多重比较。

2.2.1 浒苔生长受温度、盐度影响的方差分析结果

方差分析结果表明，温度、盐度单因子对浒苔的生长都有极显著影响（P＜0.01）。从均方值来看，浒苔生长对温度的变化更为敏感。温度和盐度对浒苔生长存在显著交互效应（P＜0.05）（表1）。

表1 温度、盐度对浒苔SGR影响的可重复两因素方差分析统计结果Table 1 The statistic results of repeatable two－factors variance analysis on the effects of temperature and salinity on the growth rate of E.prolifera

2.2.2 不同温度对浒苔生长影响的比较

在5～20℃，SGR范围是14%～35%，并存在显著差异（P＜0.05），生长率随温度增加而明显升高。在t为20～26℃，SGR达到最高（34%左右），且温度间无显著差异。但随温度继续上升至29℃，32℃时，浒苔生长率却出现了下降趋势。综上所述，浒苔生长率随温度的增加呈先升高后降低的趋势，20～26℃最适宜浒苔生长。

2.2.3 不同盐度对浒苔生长的影响

盐度对浒苔藻体生长的影响较大，随着盐度的升高生长率也在增加，其中S为26生比率最高，32时较高。S为14组SGR明显低于S为20组，低盐度组（14和20）生长率显著低于高盐组（26和32）（P＜0.05）。

2.2.4 温度和盐度的交互效应

图6 各温度、盐度条件下藻体第1～6天的SGR（%）Fig.6 Specific growth rate（SGR）of E.prolifera at different temperatures and salinities（%）

在同一盐度下，生长率随温度的增加先升高后降低。S为20～32时，浒苔最大增长率出现在20℃；S为14时浒苔在23～26℃时增长率最大。比较盐度对浒苔SGR的影响时发现，5～11，29和32℃时盐度对浒苔SGR的影响并不明显，14～26℃时盐度的影响相对明显。

第1～6天，t＞20℃与所有盐度组合下的SGR均在30% 以上，其中t为20～23℃，S为26～32时浒苔SGR均高于36%；20℃、S为26实验组SGR最高，达37.80%（如图6）。

2.3 对藻体及其繁殖体的观测

在实验过程中，也对藻体和繁殖体进行了显微观测。由于本实验温度梯度较多，将分3组进行讨论：5～11℃，14～23℃和26～32℃。

不同温度下，藻体形态随时间变化的趋势大致相同。早期藻体均以营养生长为主，主枝变粗（部分呈囊泡状或片状），分枝增殖明显（图7b）。之后，藻段（或藻体）颜色由绿色变为淡黄色（图7c），进入了生殖生长阶段。在此期间，显微镜下观察有孢子（配子）囊出现（图7d）。1d后的显微观察发现培养水中有较多游动的生殖细胞出现（图7e）。几天后观察到，在培养水体和培养器皿壁上均出现生殖细胞固着后萌发成的幼体（图7h）。

生殖生长出现的时间，26～32℃组出现的最早，5～11℃组出现的最晚。观测的详细情况见表2。

培养液中共存着浒苔的多种繁殖体，如各种类型的生殖细胞、不同时期的萌发幼体、断裂后继续营养生长的小藻段等，各种形态、数量巨大的繁殖体构成了浒苔的“繁殖体库”。

实验观察表明，相对于温度而言，盐度对生殖生长的影响并不明显。

图7 浒苔藻体的形态Fig.7 Morphological changes of E.prolfera

表2 各温度条件下的藻体形态变化及显微观察结果Table 2 Morphological changes and microscopic observation of different temperature groups

3 讨 论

3.1 藻体生长率变化与生殖生长

整个培养期内，浒苔藻体一进入生殖生长阶段，生长率会出现显著下降，5℃组，8℃组在9～15d生长率明显高于26～32℃，主要原因可能是低温组前期生长缓慢，后期仍有较多藻体处于营养生长期从而保持了较高生长率。

培养前期，26～32℃组浒苔藻体生长率较高，同时也较早地进入生殖生长阶段，而其藻体形态的表现是主枝由管状变为片状。曾有学者报道，片状叶状体的孢子释放能力要明显强于丝状或管状叶状体［3］。这与本文的结果相吻合。

3.2 浒苔最适生长的温度、盐度条件

20℃、S为26实验组的SGR最高，达37.80%。本实验中浒苔最适生长条件是t为20～26℃，S为26～32，此期间增长率能达到36%以上。与王建伟等［3］实验得出浒苔生长的最适宜的t为20～25℃、S为24～28相近。

在同一实验盐度下，浒苔SGR均随温度的增加呈先升高后降低的趋势。5～11℃和29～32℃均不利于浒苔的生长。高盐度下（S为20～32），浒苔在20℃时增长率最大，低盐度下（S为14）浒苔在23～26℃时增长率最大，低盐度下最大生长率出现的温度有升高的趋势。

3.3 藻体形态及颜色的变化

在藻体顶端的细胞容易形成生殖细胞囊［4］。但本研究中，生殖细胞囊也可能开始形成于藻体中部。成熟的叶状体形成生殖细胞囊，反映在藻段颜色变化上，是由深绿变成淡黄色，颜色变化范围由某个藻段扩展到整个藻体。形成孢子（配子）囊的藻段可在几分钟内释放大量的生殖细胞（如显微镜高光强条件下），释放后的细胞形成空壳。藻体形态和颜色的变化可以作为藻体生长阶段的标识。

3.4 浒苔繁殖体的显微观察

培养后期，对培养液显微观察发现，有大量的萌发幼体在水体中悬浮或漂浮生长。此现象说明生殖细胞可以固着于水体中微小的悬浮物上萌发生长。还有的生殖细胞固着在原藻体上萌发生长。烧杯底部出现大量的萌发幼体，主要是由于生殖细胞在重力作用下下沉后固着，萌发［8］。

培养液中、器皿壁上固着的生殖细胞以及其他各种繁殖体可以近似的看做是浒苔的“繁殖体库”［14］。但由于生殖细胞的释放，藻段的分解，致使微生物和原生动物大量繁殖。浒苔繁殖体库会因原生动物等的摄食而遭受损失。不良环境下其繁殖体能存活数月，等环境适宜它们就会萌发生长［15］。繁殖体库对于海藻的生命史至关重要，对浒苔繁殖体库的研究还有待于进一步探讨。

（References）：

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Microscopic Observation on Population Growth and Reproduction ofEntromorphraproliferaUnder Different Temperature and Salinity

ZHANG Xiao－hong1，2，WANG Zong－ling1，2，LI Ri－xiang1，2，LI Yan1，2，WANG Xiao1，2
（1.TheFirstInstituteofOceanography，SOA，Qingdao 266061，China；2.KeyLabofScienceand EngineeringforMarineEcologicalEnvironment，SOA，Qingdao 266061，China）

In order to study the effects of temperature and salinity on the growth and reproduction ofEntromorphraprolifera，ten temperature levels（5～32℃）and four salinity levels（14～32）under each temperature level were set，and the algae wet weight and specific growth rate（SGR）under different culture conditions were studied.The growth of the algae was sensitive to the changes of temperature，other than to that of salinity.At the same salinity，the SGR had a trend of increase followed with a decrease.With the decrease of the salinity，the increase of the temperature was suitable for growth.E.proliferahad a highest SGR of 37.80%at 20℃and salinity of 26.Those groups with high SGR entered reproductive phase first and followed with a sharp decrease of SGR and morphological changes of the algae.This observation will help us deeply understand the green algae bloom and evolvement process.

Entromorphraprolifera；specific growth rate；regetative growth；reproductive growth

October 11，2010

A

1671－6647（2012）02－0276－08

2010－10－11

国家重点基础研究发展计划——我国近海藻华灾害演变机制与生态安全（2010CB428703）；国家科技支撑项目——浒苔绿潮藻暴发应急处置关键技术研究与应用（2008BAC49130），青岛近海浒苔绿潮形成的生物学与生态学机制（2008T30）

张晓红（1986－），女，山东临沂人，硕士研究生，主要从事绿潮生态学方面研究.E－mail：zxh0828a＠163.com

＊通讯作者，E－mail：liruixiang＠fio.org.cn