禽流感病毒抗原表位分析及H5N1亚型基因工程疫苗设计＊

刘学东，王志亮，包振民

（1.中国海洋大学海洋生物遗传与种质工程实验室，山东青岛266003；2.青岛市市立医院呼吸科，山东青岛266003；3.中国农业部动物检疫所外来病中心，山东青岛266033）

禽流感病毒抗原表位分析及H5N1亚型基因工程疫苗设计＊

刘学东1，2，王志亮3，包振民1＊＊

（1.中国海洋大学海洋生物遗传与种质工程实验室，山东青岛266003；2.青岛市市立医院呼吸科，山东青岛266003；3.中国农业部动物检疫所外来病中心，山东青岛266033）

以亚洲地区H5N1亚型禽流感病毒（Avian Influenze Virus）流行株为研究对象，利用计算机软件，对同源性较高的HA1（Hemagglutnin，HA，血凝素）和NP（Nucleocapsid protein，核衣壳蛋白）进行全基因序列分析，优选出HA1蛋白的主要T细胞表位和B细胞表位，以及NP蛋白的主要CTL（Cytotoxicity T lymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞）表位。依据这些优选表位，设计了禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗。构建了基因工程疫苗表达载体pRSET－AIV，外源基因能够在大肠杆菌表达系统中得到良好表达。表达产物免疫小鼠后，血清中Ig A和IgG抗体水平明显上升，在体外培养脾细胞可产生IL－2、IL－4和IFN－γ细胞因子。验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性，证实该基因工程疫苗在免疫小鼠体内激发体液免疫的同时调动了细胞免疫。

禽流感；基因工程疫苗；抗原表位；H5N1

禽流感（Avian Influenze，AI）是1种禽类的烈性传染病，人类也是禽流感病毒的易感宿主。目前疫苗的研究和应用是控制禽流感的主要措施。其中禽流感表位疫苗的研究是最为主要的热点［1－2］，禽流感病毒表面蛋白HA上有很多抗原表位［3］，能特异地与T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）和B细胞抗原受体（B cell receptor，BCR）结合的T细胞表位和B细胞表位［4－5］。将T、B细胞表位以特定的方式注入机体，可诱导有效免疫应答。但现有的表位多肽疫苗分子过小，单独使用时，易降解，免疫原性较弱，难以诱导强而持久的免疫应答。因此，本研究通过计算机辅助设计了以HA主要B细胞抗原表位为主体，以特异性和非特异性T细胞表位为辅的新型H5N1亚型禽流感基因工程疫苗。该疫苗理论上具有亚单位疫苗的优势，能够充分调动机体的体液免疫，而且由于添加了特异性和非特异性T细胞表位，还能赋予该疫苗调动机体细胞免疫的能力，从而对不同亚型的禽流感病毒具有一定交叉保护能力。该疫苗的设计综合了禽流感亚单位疫苗和表位疫苗的优点，具有互补性，能有效弥补亚单位疫苗和表位疫苗各自的不足。

1 材料方法

1.1 国内流行H5N1毒株的HA和NP蛋白序列的选择

利用Influenza Sequence Database和NCBI的Blast和Tree分析比较国内H5N1流感病毒的HA和NP蛋白序列，选择2004年以来发表的拥有共同序列最多、Blast分析同源性最高（与中国及周边国家，尤其是东南亚国家发表H5N1毒株序列相比）的HA1蛋白和NP蛋白，作为表位分析和疫苗设计的参照序列。

1.2 MHC II细胞表位及CTL表位的选择

利用Net MHCII2.1对选定HA1蛋白进行CD4＋T细胞表位分析；利用NetCTL1.2 NP蛋白进行CTL表位分析，各类Subtype的表位各选择1个，选择标准：（1）C端被蛋白酶体处理分值大于0.5；（2）TAP转送分值大于0.5；（3）对已有文献报道确认的CTL表位也予以选择。

1.3 禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗蛋白结构与编码基因设计

含有CD4＋T细胞表位和B细胞表位的HA1置于疫苗N端，在其C端连接CTL表位。CTL表位两端多带1个该表位在NP蛋白中相邻的氨基酸，将这些表位合理连接，然后整体分析，选择不产生高分值连接表位的CTL表位串接设计，获得 疫苗氨基酸序列，再利用infor Max公司的Vector NTI 8.0的Back Translation功能选择Escherichia coli的Codon Usage Table，获得禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗蛋白编码基因，再根据大肠杆菌优势密码子进行A、T、G、C的平衡，并控制编码基因中常用酶切位点，最终获得该禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗蛋白编码基因，基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成并行DNA序列测定。

1.4 工程疫苗的表达及目的蛋白纯化复性

用PstⅠ＋HindⅢ双酶切消化人工合成的H5N1亚型基因工程疫苗编码基因，酶切片段插入p RSET B表达质粒，构建工程疫苗的表达载体p RSETAIV，测序验证；将含有p RSET－AIV质粒的大肠杆菌BL21（DE3）菌株用1 mmol／L IPTG诱导3 h，以表达H5N1亚型基因工程疫苗；离心收集菌体，超声波破碎，沉淀以6 mol／L盐酸胍，20 mmol／L Tris－HCl（p H＝8.0），0.3%β－ME充分溶解后，以Ni＋亲和柱对目的蛋白进行吸附，8 mol／L尿素，20 mmol／L Tis－HCl，200 mmol／L咪唑，0.1%β－ME洗脱，收集洗脱峰。采取稀释复性的方法对禽流感病毒H5N1亚型基因工程疫苗进行复性。

1.5 基因工程疫苗的免疫效力检测

将复性好的蛋白疫苗以PBS配制成40μg／mL的蛋白溶液，分别以等体积ISA 50V2佐剂和不完全福氏佐剂进行乳化制成疫苗。选取正常体重约20 g昆明种小鼠12只，随机分为A、B 2组，A组以ISA 50V2佐剂乳化的疫苗免疫，20μg／只，并分别于免疫后3、5周，用相同剂量不完全福氏佐剂乳化疫苗加强免疫1次；B组为PBS对照组。每次免疫的7 d后断尾采血，以方法1.4所获抗原蛋白包被酶标板，5μg／孔，ELISA（抗体购自SIGMA公司）检测小鼠血清中IgG和Ig A抗体水平。

1.6 免疫小鼠的细胞因子水平检测

将方法1.5中免疫6周后的小鼠，引颈处死，无菌条件下摘取脾脏，分离脾细胞，以1×106个／孔的密度接种入24孔板中，平行接种6孔，向其中3孔中分别加入100μL（0.1μg）疫苗蛋白，其他3孔中加入100 μL PBS作为空白对照，于CO2培养箱中37℃培养24 h后，收集培养上清，ELISA方法检测培养上清中IL－2、IL－4和IFN－γ的含量（试剂盒为Adlitteram Diagnostic laboratories公司产品）。

2 结果

2.1 国内流行H5N1毒株的HA和NP蛋白序列的选择

经过大量的序列比对工作，最终选择了中国2004年在华东、河北、河南、广东和广西发现的流行毒株的HA1作为疫苗设计的标准参照序列（该序列Gene－Bank收录号：Q80A26）；NP蛋白序列则选择了大陆和香港高同源性的序列作为标准参照序列（该序列Gene－Bank收录号：Q6J8B1）。

2.2 HA1蛋白的MHC II表位和NP蛋白的CTL表位分析及H5N1亚型基因工程疫苗蛋白结构

利用Net MHCII2.1 server对选定的HA1蛋白进行MHC II表位预测分析后，发现本研究所选择的流行毒株的HA1蛋白其中包含多种强势MHC II型T细胞表位，因此直接选用原HA1蛋白序列，没有再添加额外的通用型T细胞表位；而对选定的NP蛋白进行分析后，共筛选出了5个CTL表位应用于疫苗设计中。最终获得的全新禽流感表位疫苗氨基酸序列如下：

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH

AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCS

VAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKA

SPANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINH

FEKIQIIPKSSWSNHEASSGVSSACPY

LGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSY

NNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTR

LYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATR

SKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAIN

FESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSE

LEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIH

PLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNGYSLV

GIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSWH

SNLNDATYQRTRALVRTGRMVSGIG

RFYVWMASHSAAFEDLRVSSMEAMD

SNTLELRSRYWAIRTR

2.3 H5N1亚型基因工程疫苗的表达、纯化

将构建正确的p RSET－AIV质粒的大肠杆菌BL21（DE3）菌株在经过1 mmol／L IPTG诱导3 h后，在预期分子量45k D处有明显新生条带出现（见图1），表明外源基因能够在大肠杆菌表达系统中得到良好表达。经过细胞破碎后离心，目的蛋白以包涵体形式存在于沉淀中，Ni＋亲和纯化后，目的蛋白纯度可达95.5%（见图1）。

图1 重组AIV疫苗纯化蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.1 SDS－PAGE of purified recombinant AIV vaccine

2.4 免疫小鼠血清中的Ig A抗体和IgG抗体水平

免疫小鼠血清中Ig A和IgG抗体检测的实验结果如图2所示，注射H5N1亚型基因工程疫苗的免疫小鼠血清中的抗体水平明显上升。

图2 ELISA检测不同免疫期Ig A和IgG抗体水平Fig.2 Induced Ig A and Ig Gtitres in different immunizing periods（detected by ELISA）

2.5 H5N1亚型基因工程疫苗诱导的细胞因子反应

在检测的各种细胞因子中，在体外培养脾细胞中加入纯化的抗原蛋白后可有效刺激IL－2、IL－4和IFN－γ产生，具体数值见表1（P＜0.05，n＝3）。其中IL－2和IL－4的增高最为明显。

表1 体外培养的小鼠脾细胞产生的细胞因子水平Table 1 In vitro cytokine levels in spleen cells from mouse／pg·m L－1

3 讨论

在禽流感疫苗设计过程中，为了保证所设计疫苗的有效性和广谱性，本研究首先对近年来流行的禽流感病毒H5N1亚型的HA和NP蛋白进行了数据库比对和序列分析，确定了禽流感HA1和NP蛋白的参考序列，所选择的HA参考序列与国内和周边地区的流行毒株序列一致性高于95%，相似性大于97%，该序列与国内7个不同地域的流行毒株发表序列完全一致，进化树分析显示该序列与目前国内使用的疫苗株HA1蛋白序列同源性很高，具很高的可信度；在NP蛋白序列比对过程中，发现NP蛋白序列相对保守，国内流行的H5N1毒株NP蛋白一致性高达98%，因此选择了基因库中中国大陆和香港一致序列最多的NP蛋白序列作为疫苗设计的NP蛋白参考序列。

MHC分子是TCR识别病毒蛋白T细胞表位的基础［6］，在疫苗中引入覆盖多种DR类型的MHCⅡ表位是目前改善亚单位疫苗的免疫效果的重要手段，目前禽类MHCⅡ分子结构、功能及其相关性研究较欠缺，应用生物信息学技术来预测禽流感病毒抗原T细胞表位的研究目前较少。本研究利用计算机辅助预测法对所确定的禽流感HA1和NP蛋白参考序列进行了表位分析，发现HA1分子内含多个可与MHCⅡ多个DR类型高效结合的强势T细胞表位，其中有部分表位已有文献支持［7－8］。另外，为了平衡调动免疫个体的体液免疫和细胞免疫，研究中还对选定的禽流感HA1和NP蛋白参考序列进行了CTL强势表位计算机辅助分析，选取了5个高亲和力CTL表位作为疫苗设计中的重要元件，其中部分CTL表位已被证明具有调动特异性细胞免疫的效果［9－10］。

考虑到禽流感病毒变异快，易于逃避宿主免疫防御，研究中选择了多个抗原上的多个表位来刺激机体产生更强的体液免疫和细胞免疫，使机体具有较广泛的免疫保护能力［11］，将含有主要保护性B细胞表位和覆盖多种DR类型的MHCⅡ表位的H5N1病毒HA1蛋白作为疫苗的主体骨架，使其具备了亚单位疫苗的特性；同时在该骨架C端又引入了从比较保守的NP蛋白的CTL细胞表位，不但能够加强该疫苗的细胞免疫能力，而且能够提高该疫苗抵抗H5N1变异株免疫逃逸的能力，最终形成了Th细胞表位＋B细胞表位＋CTL表位的多表位串联型全新抗原结构，同时优化了B细胞表位和T细胞表位的相对定位；在CTL表位间的间隔序列优化设计中，主要利用CTL表位两端多带1个该表位在NP蛋白中相邻的氨基酸，连接后整体分析，选择不产生高分值连接表位的CTL表位串接设计，最终完成了整个疫苗全序列的设计。该疫苗最终在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。进一步的小白鼠实验充分验证了该H5N1亚型基因工程疫苗的抗原性，同时，该疫苗可引起小白鼠体内细胞因子水平的变化，证明在激发体液免疫的同时也调动了细胞免疫。

本文研究表明了禽流感H5N1亚型基因工程疫苗具有很强的免疫效力，基于基因工程的自身优势，该疫苗可以作为以防御禽流感疫病高致病性毒株为主低致病性毒株为辅的新型复合疫苗进行进一步的研究开发。

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Analysis of Avian Influenza Virus Epitopes and the Design of H5N1 Virus Genetic Engineering Vaccine

LIU Xue－Dong1，2，WANG Zhi－Liang3，BAO Zhen－Min1
（1.Genetics and Breeding Laboratory，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Respiratory Department of Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266003，China；3.National Diagnostic Center for Exotic Animal Diseases，Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China，Qingdao 266033，China）

In this study，we choose the asian H5N1 subtype avian influenza virus，use software to analyze the gene sequences of the HA1（Hemagglutnin，HA，hemagglutinin）and NP（Nucleocapsid protein，capsid protein），and optimize major Tcellepitopes and Bcell epitopes of the HA1 protein and the major CTL（Cytotoxicity Tlymphocyte cytotoxic T lymphocyte）epitope of the NP protein.According to these preferred epitopes，we designed the avian influenza virus subtype H5N1 recombinant vaccine.Genetically engineered vaccine expression vector p RSET－AIV was constructed，exogenous gene can be well expressed in E.coli system.Mice immunized with expression products，serum Ig A and IgG antibody levels were significantly increased，IL－2，IL－4 and IFN－γcytokines were tested in vitro spleen cells.The antigen of genetic engineering was verified.It's confirmed that the vaccine stimulates the cellulat's immunity while it activates the humoral immunity.

avian influenza；vaccine；epitope；H5N1

Q812

A

1672－5174（2012）04－055－04

2011－06－15；

2011－09－13

刘学东（1969－），女，博士，硕导，从事呼吸科临床工作及细菌学研究。E－mail：xuedongliu＠263.net

＊＊通讯作者：E－mail：zmbao＠ouc.edu.cn

责任编辑 朱宝象