海豚链球菌3种免疫原对牙鲆血细胞吞噬及SOD、POD和ACP活力的影响＊

赵 娜，唐小千，绳秀珍，战文斌

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003）

海豚链球菌3种免疫原对牙鲆血细胞吞噬及SOD、POD和ACP活力的影响＊

赵 娜，唐小千，绳秀珍＊＊，战文斌

（中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003）

本文制备海豚链球菌（Streptococcus iniae）强毒株NUF849的福尔马林灭活全菌（FKC）、胞外产物（ECPs）以及全菌与胞外产物的混合物（FKC＋ECPs）3种免疫原，以其免疫牙鲆（Paralichthys olivaceus），并在免疫牙鲆后第42天分别以海豚链球菌NUF849和NUF812攻毒。在免疫牙鲆后第7、14、21、28、35、42天及攻毒后第7天分别取样，测定血细胞吞噬能力及血清中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和酸性磷酸酶（ACP）的活力，以比较3种免疫原对这些免疫指标的影响。结果显示，免疫后尤其攻毒后，红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞等的吞噬率与吞噬指数均上升，FKC＋ECPs组显著高于其他组（P＜0.05）；各免疫组SOD活力随时间延长而下降并趋于稳定，攻毒后各组数值有不同程度的升高，但FKC＋ECPs组数值最低；免疫组POD活力先升高，第28天起下降，攻毒后各组均下降，FKC＋ECPs组始终高于其他免疫组（P＜0.05）；免疫组ACP活力也在免疫后第28天达到峰值，以某株NUF849攻毒后FKC＋ECPs组水平上升（相对于免疫后第42天），其他组显著下降；FKC、ECPs、FKC＋ECPs对菌株NUF849的相对免疫保护率分别为50%、40%和90%，对NUF812的相对免疫保护率分别为60%、30%和80%，FKC＋ECPs组显著高于其他组（P＜0.05）。以上研究表明，各免疫组均诱导了牙鲆的非特异性免疫应答，具有一定的免疫保护效果，其中FKC＋ECPs组效果最佳。

海豚链球菌；免疫原；非特异性免疫；牙鲆

海豚链球菌（Streptococcus iniae）最初分离自亚马逊淡水海豚［1］，是1种条件致病性的人畜共患细菌病病原［2］，革兰氏阳性，可感染多种水生动物，如牙鲆（Paralichthys olivaceus）［3］、罗非鱼（Oreochromis nilotica）［4］、鰤鱼（Naucrates ductor）［5］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［6］等，对水产养殖业造成严重危害。因此，开发安全高效的疫苗以实现链球菌病的有效防治是当前研究的重点和热点。目前，国内外已报道多种形式的海豚链球菌疫苗，如福尔马林灭活全菌（FKC）疫苗［7－10］，胞外产物（ECPs）、类M蛋白亚单位疫苗［10－11，13］，混合组分的疫苗（FKC＋ECPs）［9－10］，菌蜕疫苗［12］，弱毒或减毒活菌疫苗［13－14］，DNA疫苗［15］等。其中，FKC制备方便、成本低廉，常被选作疫苗成分，但其免疫保护力不理想且交叉保护效果差，使其应用受限［10］；FKC＋ECPs成分的疫苗则能够有效辅助罗非鱼［9］、牙鲆［10］抵抗免疫原来源菌株及非免疫原来源菌株的侵袭。然而，针对不同免疫原所引起的鱼体免疫应答差异的研究较少，尤其缺乏对非特异性免疫的关注。鱼类是较低等的脊椎动物，其特异性免疫机制还很不完善，多数硬骨鱼类体内只有1类免疫球蛋白Ig M，且其抗体形成周期长、抗体滴度不高，因此非特异性免疫在鱼类的免疫防御中发挥着重要作用［16］。对鱼体非特异性免疫应答的研究可辅助评价免疫原的免疫效果，有助于对不同免疫原作用机制的了解。

本文选用牙鲆为实验动物，测定了血细胞吞噬能力及血清中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和酸性磷酸酶（ACP）的活力变化，对海豚链球菌强毒株NUF849来源的3种免疫原（FKC、ECPs及FKC＋ECPs）产生的影响进行比较分析，以期为筛选链球菌疫苗有效成分，深入了解牙鲆针对不同免疫原所产生的非特异性免疫应答机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康牙鲆购自日照某养殖场，体质量为（20±5）g，蓄养于40 cm×40 cm×70 cm水槽内，水温为（23±1）℃，不间断充气，日换水2／3，日投喂1%鱼体质量的商品化饲料。无菌取内脏组织平板划线、尾静脉取血进行抗体检查，暂养7 d证实牙鲆无病原感染后用于实验。

海豚链球菌NUF849、NUF812由Nagasaki University惠赠。经预实验测定，菌株NUF849和NUF812对实验牙鲆的半数致死量（LD50）分别为3.7×105CFU·m L－1和1.0×106CFU·m L－1，均具较强毒力。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由本室保存。

培养基为哥伦比亚血平板（海博），脑心浸液（BHI）（Difco），普通营养琼脂（奥博星）。酶活试剂盒购于南京建成生物工程研究所，其他试剂均购于上海生工。

1.2 细菌培养与胞外产物制备

海豚链球菌NUF849和NUF812经血平板28℃活化24 h，转接于BHI平板富集培养，以0.01 mol·L－1无菌磷酸盐缓冲液（PBS，p H＝7.4）洗脱，离心（3 000 r／min，15 min，4℃），弃上清，重复洗涤3次收集菌体，用于疫苗制备及攻毒。金黄色葡萄球菌以普通营养琼脂培养，同法洗涤备用。

以平板玻璃纸法制备海豚链球菌胞外产物［17］。活化后菌株接种于BHI肉汤，28℃静置培养24 h；取1 m L培养物涂布于预先铺覆1层灭菌玻璃纸的BHI平板（直径15 cm），28℃培养60 h；无菌PBS洗下菌苔，收集菌悬液离心（8 000 r／min，20 min，4℃）；上清经0.22μm微孔滤膜除菌，超纯水4℃透析后冻干，以PBS重悬，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，分装贮存于－20℃备用。

1.3 免疫原的处理与安全性检测

经麦氏比浊仪（Bio Mérieux）测定菌液浓度，以无菌PBS调整至109CFU·m L－1，加入福尔马林使终浓度为0.4%，37℃振摇灭活48 h［18］。PBS洗涤细菌以去除福尔马林。涂布平板检测无活菌后，4℃备用。制备的FKC（108CFU）、ECPs（30μg）、FKC＋ECPs（FKC 108CFU＋ECPs 30μg）分别与弗氏完全佐剂等体积混合（见表1），每种免疫原注射5尾牙鲆，正常饲养观察7 d以检测其安全性。7 d后受试鱼均健康存活，表明免疫原安全性良好。

表1 牙鲆的免疫分组Table 1 The vaccination of Japanese flounder

1.4 免疫与攻毒

设3个免疫组与PBS对照组（见表1），每组牙鲆150尾，分别腹腔注射FKC、ECPs、FKC＋ECPs 3种免疫原与PBS，并以红霉素软膏涂抹入针处。在免疫后第42天，每组随机取鱼80尾并平分为NUF849组和NUF812组，分别腹腔注射10倍LD50（NUF849：106CFU·mL－1，NUF812：107CFU·mL－1）的菌液0.1 mL进行攻毒，然后将NUF849组和NUF812组再随机等分为观察组与取样组（见表2），养殖条件同1.1，观察21 d，及时清除死亡鱼并统计死亡情况，按下列公式计算相对免疫保护率（RPS）［19］：

RPS（%）＝（对照组死亡率－免疫组死亡率）／对照组死亡率×100%。

表2 牙鲆的攻毒分组Table 2 The challenge of Japanese flounder

1.5 采血

以7 d为取样间隔［8－9，15］，于免疫后第7、14、21、28、35、42天及攻毒后第7天，每组随机取鱼5尾，尾静脉分别取血混合，并将血样分为2份。一份以肝素钠抗凝用于吞噬实验；另一份于室温倾斜放置1 h，4℃放置2 h，离心（3 000 r／min，10 min，4℃）获得血清，分装后保存于－80℃，用于测定酶活力。

1.6 血细胞吞噬能力检测

参考Soveyi等［20］的方法，取0.1 m L抗凝血，加30μL 1.0×109CFU·m L－1热灭活金黄色葡萄球菌菌液，室温放置1 h，期间每隔10 min摇动1次。取混合液涂片，自然风干，甲醇固定，Giemsa染色，油镜下观察计数。每组取3份血样，每份涂片3张，每片随机选取10个视野，按以下公式计算吞噬百分数（PP）和吞噬指数（PI）：

PP＝100个血细胞内参与吞噬的细胞数／100×100%；

PI＝100个血细胞内吞噬细菌的总数／100个血细胞内参与吞噬的细胞数×100%。

1.7 血清中3种免疫相关酶活性变化

血清经无菌PBS稀释1倍，以试剂盒测定其中SOD、POD、ACP活力。每组4个平行，重复测定3次。

1.8 统计

利用软件Origin 8.0对数据进行处理，所得数据均表示为均值±标准误的形式（±SE），t检验比较组间差异。

2 结果

2.1 血细胞吞噬能力

免疫后及攻毒后，红细胞（见图1－A）、淋巴细胞（见图1－B）、单核细胞（见图1－C）、嗜中性粒细胞（见图1－D）、血栓细胞（见图1－E）等均发生吞噬，其中红细胞表现出较强的吞噬能力。单核细胞、淋巴细胞多伸出指状或丝状伪足，其他细胞出现胞质凹陷吞噬细菌。

图1 参与吞噬的牙鲆血细胞（标尺＝10μm）Fig.1 Blood phagocytes of Japanese flounder（Bar＝10μm）

免疫后各组PP为10%～28%（见图2）。ECPs组与FKC＋ECPs组PP由免疫后第7天的近20%上升至第42天的30%左右；FKC组PP平缓上升，显著低于FKC＋ECPs组及ECPs组（P＜0.05）；PBS组PP基本稳定，显著低于各免疫组（P＜0.05）。相对于免疫后第42天，以NUF849攻毒后第7天，各组PP均上升，尤其FKC＋ECPs组升高至52.62%；以NUF812攻毒后第7天，FKC组与PBS组PP均上升，ECPs组PP则下降，而FKC＋ECPs组无明显变化。

免疫后各组PI为1.18～1.45（见图3）。免疫后第7～35天，免疫组PI均显著高于PBS组（P＜0.05）；FKC组PI上升较慢，在第14天上升至ECPs组与FKC＋ECPs组的水平，随后在第35天降至PBS组水平；直至第42天，ECPs组PI无明显下降，FKC＋ECPs组PI降至PBS组水平。相对于免疫后第42天，以NUF849攻毒后第7天，FKC组、FKC＋ECPs组及PBS组PI值均上升，其中FKC＋ECPs组与PBS组升高至1.50左右；NUF812攻毒后第7天各组PI均上升，且PBS组＞FKC组＞ECPs组＞FKC＋ECPs组。

2.2 血清中SOD、POD、ACP酶活力变化

各组SOD活力（见图4）在免疫后第7～42天随时间下降，而ECPs组下降趋势较缓，在28 d显著高于其他组（P＜0.05）；在第35天和42天各组SOD活力趋于稳定。相对于免疫后第42天，以NUF849攻毒后第7天，PBS组和FKC组SOD活力显著上升（P＜0.05），ECPs组与FKC＋ECPs组略上升，而FKC＋ECPs组最低；以NUF812攻毒后第7天，PBS组SOD活力升高（P＜0.05），其他组无明显变化。

免疫组POD活力（见图5）在第28天停止升高开始下降，FKC＋ECPs组值显著高于FKC组与ECPs组（P＜0.05）；除FKC＋ECPs组免疫后第28天的POD活力高于PBS组外，免疫组POD活力均低于PBS组。相对于免疫后第42天，NUF849攻毒后第7天POD活力下降，FKC＋ECPs组显著高于其他组（P＜0.05）；以NUF812攻毒后第7天，各组POD活力均下降，组间差异不显著（P＞0.05）。

免疫组ACP活力（见图6）在第21天以后显著高于PBS组（P＜0.05），第28天达到峰值，FKC组显著高于其他组（P＜0.05）。以NUF849攻毒后第7天，FKC＋ECPs组ACP活力相对于免疫后第42天有所上升，且显著高于其他组（P＜0.05）；其余各组ACP活力均下降。以NUF812攻毒后第7天，各组ACP活力均下降，PBS组几乎降至0。

2.3 免疫保护力

在免疫后第42天以菌株NUF849与NUF812分别攻毒，部分牙鲆表现出典型链球菌感染症状，即体色发黑、眼球白浊、游动迟缓、呼吸困难，解剖可见黄色或血样腹水，肝脏充血，脾肿大，肾脏色深，胆汁色浅，肠壁变薄、肠腔积液，脑组织与内脏中可分离到链球菌。PBS组为第2天（NUF849）和第3天（NUF812）开始出现死亡，在第10天（NUF849）和第15天（NUF812）死亡率达到100%；3个免疫组在攻毒后出现死亡的时间均迟于PBS组，其中FKC＋ECPs组出现死亡的时间最晚。FKC、ECPs、FKC＋ECPs3组均表现出一定免疫保护效果，对菌株NUF849的RPS分别为50%、40%和90%，对NUF812的RPS分别为60%、30%和80%，FKC＋ECPs组显著高于其他组（P＜0.05）（见图7，8）。

3 讨论

吞噬以及免疫相关酶类的作用是鱼类非特异性免疫的重要组成部分［16］。本文比较了海豚链球菌3种免疫原（FKC、ECPs及FKC＋ECPs）所引起的牙鲆血细胞吞噬能力及血清中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和酸性磷酸酶（ACP）活力的变化，证实3种免疫原可不同程度地诱导牙鲆非特异性免疫应答。

病原菌能够诱导鱼体产生趋化因子，在趋化因子和细菌成分及其代谢产物的共同作用下，吞噬细胞能够接近抗原物质，通过吞噬或吞饮的方式将病原菌吞入［16］。用于研究鱼类吞噬能力的材料多是血液中的白细胞，由于牙鲆红细胞具有较强的吞噬能力［21］，本文计数了全血细胞，结果证实牙鲆红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、血栓细胞等均具有吞噬能力。免疫后各免疫组PP、PI均有升高，表明3种免疫原可促进牙鲆血细胞的吞噬能力，尤其FKC＋ECPs组。其中，FKC＋ECPs组与ECPs组的PP值以及PP值上升速度均高于FKC组，且FKC＋ECPs组的PP值在以NUF849攻毒后达52.62%，显著高于其他组（P＜0.05），说明FKC＋ECPs包含的丰富生物分子能够更好地诱导吞噬细胞对外源物质进行吞噬。ECPs在其中起了重要作用，可能是由于其中存在的多种有丝分裂原有效刺激了淋巴细胞的增生与分化从而促进血细胞吞噬［22－23］。Lee等［24］研究亦发现，适量的Edwardsiella tarda强毒株ECPs能有效激发牙鲆的细胞免疫，促进吞噬作用，可作为良好的疫苗佐剂；Chen等［25］用Mycobacterium spp.的ECPs免疫虹鳟（Oncorhynchus mykiss），血细胞PP也出现了显著提高，同样证实了ECPs的免疫促进作用。同时，PP和PI数值的变化程度表明，3种免疫原能使参与吞噬的细胞比例（PP）提高，而对单个细胞吞噬能力（PI）的促进无显著作用。

超氧化物歧化酶（SOD）催化过氧阴离子发生歧化生成过氧化氢和氧，是清除体内自由基的首要物质，当机体处于应激状态时，其活力相应变化，以消除细胞损害、促进吞噬等［26］。本文中各免疫组SOD活力表现出不同变化规律，总体趋势随时间下降，在第35天后趋于稳定，说明牙鲆由注射后的应激状态恢复正常。在以NUF849攻毒后第7天，各组SOD活力上升，表明牙鲆因活菌刺激又进入了应激状态。而FKC＋ECPs组与ECPs组SOD活力维持于相对低的水平，可能由于FKC＋ECPs与ECPs更好地激发了牙鲆的免疫应答，使大部分受免疫牙鲆能够有效地抵抗病原菌的侵染、维持稳定状态。在病原入侵、环境胁迫与免疫增强剂作用等情况下，机体SOD活力可能升高［27］、降低［28－30］或无显著变化［31－32］，也有研究指出其活力与诱导因素之间存在剂量效应关系［33－34］，其具体调节机制仍不明确。所以，不能单纯依据SOD活力数值的升降来判断机体免疫力的高低，应结合其他指标具体分析。

过氧化物酶（POD）与过氧化氢酶（CAT）同为SOD下游酶类，催化过氧化氢与氢供给体之间的氧化反应，促进细胞内呼吸爆发，进而提高粒细胞对外源异物的吞噬能力［35－36］。本文在攻毒前免疫组POD活力先升后降，在35和42 d趋于稳定，与SOD相似，说明2种酶在免疫后的变化可能是由于牙鲆对注射的应激；以NUF849攻毒后，FKC＋ECPs组POD活力升高且显著高于其他组（P＜0.05），同时SOD活力也上升，说明FKC＋ECPs能够快速激活牙鲆抗氧化体系，进而提高其吞噬能力与免疫保护力。本文POD与SOD的变化，符合抗氧化酶体系成分间相互制约、相互作用，以达到动态平衡从而抵抗细胞损害的规律［37］。

ACP是吞噬溶酶体的重要组成部分，在血细胞进行吞噬和包囊反应中会伴随ACP释放。对于被识别并吞噬的病毒或细菌，溶酶体能将其杀死并进一步降解。ACP活力会随着病原、外物入侵而变化［38］。本文中免疫后牙鲆ACP活力在第28天达到峰值后下降，说明免疫原、免疫操作等激活了牙鲆的免疫系统，随时间推移其回复正常状态；以NUF849攻毒后，FKC＋ECPs组ACP活性显著高于其他组（P＜0.05），其变化规律与该组的吞噬能力相对应，呈正相关关系，这与2次接受细菌刺激的栉孔扇贝（Chlamys farreri）ACP活力与吞噬能力高于对照组［39］的结果类似。

免疫后第42天，各项指标组间差异减弱，表明牙鲆状态已趋于稳定，因此本文选取这一时间点分别以菌株NUF849和NUF812攻毒。结果表明免疫组均表现出不同程度的免疫保护力。在停乳链球菌（Streptococcus difficile）疫苗的研究中，ECPs对疫苗来源菌株的攻毒表现出92%的RPS［40］，高于本文的40%（NUF849）及30%（NUF812），这可能是免疫剂量对比悬殊所致（400μg／尾：30μg／尾）；而Shin等［10］报道在免疫7 d后攻毒，海豚链球菌ECPs未能起到免疫保护作用，这可能与菌株差异、ECPs制备方法、免疫周期等因素有关。本文中FKC＋ECPs组对不同菌株攻毒分别表现出90%（免疫原来源菌株）、80%（非免疫原来源菌株）的高RPS，且能够明显延缓牙鲆的死亡；在海豚链球菌［10］及无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）［41］疫苗的研究报道中，FKC＋ECPs同样表现出高的保护力，效果优于FKC，与本文结果一致。这表明ECPs可能在激发鱼体免疫应答、辅助提升免疫效果中起了积极作用，在链球菌疫苗研制中可能存在重要意义。

另外，NUF812攻毒后各项免疫指标的变化异于NUF849，PP、PI、SOD、POD、ACP值均未表现出如NUF849攻毒后的显著组间差异。这可能由于2菌株毒力、侵袭速度等存在差异［10］，同为攻毒后7 d分别注射了NUF849与NUF812的牙鲆却处于不同的感染阶段，其具体原因仍需进一步研究。

本文结果表明，相对于FKC和ECPs，FKC＋ECPs形式的免疫原制剂能更大程度地影响牙鲆血细胞吞噬能力及血清中SOD、POD和ACP活力，提供交叉保护力并更有效地保护牙鲆抵御海豚链球菌病原的侵袭，其中ECPs可能起到了重要辅助作用。链球菌ECPs是重要的毒力因子同时也具有抗原性。相对于菌体抗原，ECPs在感染过程中与宿主的接触更为直接，将其作为疫苗成分之一，可补充灭活全菌的抗原损失，模拟实际的感染状态，从而激发更加有效的免疫应答。本文证实了3种免疫原均诱导了牙鲆的非特异性免疫应答，具有一定的免疫保护效果，研究数据为疫苗效果评价提供重要参考。

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Effects of Three Types of Streptococcus iniae Immunogen on Phagocytes，SOD，POD and ACP in the Blood of Japanese Flounder，Paralichthys olivaceus

ZHAO Na，TANG Xiao－Qian，SHENG Xiu－Zhen，ZHAN Wen－Bin
（The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

s:Three types of immunogen were derived from NUF849，a virulent Streptococcus iniae isolate.Healthy Japanese flounders（Paralichthys olivaceus）were vaccinated by the three types of immunogen，formalin－killed cells（FKC），extracellular proteins（ECPs）and mixture of the former two components（FKC＋ECPs），using PBS as control.At 42 d post－vaccination，flounders were challenged by the homologous（NUF849）and the heterologous isolates（NUF812）respectively.Blood sampling was carried out at 7，14，21，28，35，42 d post－vaccination and 7 d post－challenge respectively.The phagocytic activities，superoxide dismutase（SOD）activities，peroxidase（POD）activities and acid phosphatase（ACP）activities were detected in the blood collected from the caudal veins of fishes.After vaccination，the values of phagocytic percentage and phagocytic index both rose in vaccinated flounders，especially in Group FKC＋ECPs and Group ECPs，and after challenged，the two values in Group FKC＋ECPs reached the top，52.62%and 1.55，respectively.The SOD activities decreased gradually after vaccination and there was slight difference among groups，while significant difference（P＜0.05）appeared after challenged with the rise of values.Group FKC＋ECPs held the lowest value.For the POD activities，except for the value at 28 d in Group FKC＋ECPs，all vaccinated flounders showed lower values than Group PBS，but fishes in Group FKC＋ECPs showed higher values than the other vaccinated fishes.After challenged，the POD activities came down in all groups，with the smallest change in Group FKC＋ECPs.At 28 d post－vaccination，ACP activities value of vaccinated fishes stopped climbing up and began to decrease.The Group FKC＋ECPs showed higher values than the other groups under the stimulation of NUF849（P＜0.05）.Meantime，FKC，ECPs and FKC＋ECPs induced the relative survival of 60%，40%and 90%（NUF849）and 50%，30%and 80%（NUF812）after challenged，respectively.In summary，the highest nonspecial immune ability was observed in the flounders treated by FKC＋ECPs，because they showed significantly higher phagocytic activities，distinct enzyme activities and the highest relative percent survival.

Streptococcus iniae；immunogen；nonspecial immune response；Paralichthys olivaceus

S943

A

1672－5174（2012）04－033－08

国家自然科学基金项目（31172429；31072232）；山东省自然科学基金项目（ZR2011CQ022）资助

2011－05－13；

2011－09－10

赵 娜（1984－），女，硕士生，从事水产动物病害与免疫学研究。E－mail：penguinzn＠yahoo.com.cn

＊＊通讯作者：E－mail：xzsheng＠ouc.edu.cn

责任编辑 王 莉