肝癌胃癌组织中端粒酶活性的检测及其与癌组织病理类型关系的研究

延长油田股份有限公司青化砭采油厂卫生所（延安716000） 杨东梅

端粒酶（Telomerase）是一种核糖核蛋白酶，能以自身RNA为模板，逆转录合成端粒DNA，以维持端粒的一定长度，端粒的一定长度是维持细胞正常分裂及其寿命所必需的［1］。正常机体细胞除生殖细胞和干细胞外，均测不到端粒酶活性。近年来的研究发现，多种人类恶性肿瘤组织端粒酶活性显著升高，端粒酶活化与恶性肿瘤的发生发展密切相关［1］。本文用端粒酶PCR－ELISA法对不同病理类型的肝癌和胃癌组织标本进行了端粒酶活性检测与研究，旨在探讨端粒酶在肝癌和胃癌组织中的表达情况及其与肿瘤病理类型的关系，并为肝癌和胃癌诊断提供一种分子标记物。

材料与方法

1 肝癌和胃癌标本分型与处理 肝癌标本分为四型：块状型（单个或多个融合癌块直径＞5cm）；结节型（癌结节数目不等，直径介于3～5cm）；小肝癌（孤立的直径＜3cm的癌结节，或相邻两个癌结节直径之和＜3cm）；弥散型（癌组织呈弥散分布无明显结节或呈米粒至黄豆大小49篇结节散布于全肝）。胃癌标本分为五型：乳头状腺癌，管状腺癌，低分化腺癌，印戒细胞癌，未分化癌。所有标本均经病理检查确诊。标本采集后立即置于液氮中，然后移到－80℃低温冰箱中保存。端粒酶提取与检测的全套试剂为德国Boehringer Manheim公司产品。

2 端粒酶提取与活性检测 用端粒酶PCRELISA法对肝癌和胃癌标本及非癌肝胃组织标本进行端粒酶活性检测。操作方法简述如下：各组织标本50mg在200μl预冷的裂解液中匀浆化，置碎冰中作用30min，在4℃下20000r／min离心20min，取上清液保存于－80℃备用。每份样品用25μl反应混合液，加入2μl细胞提取液（30μg蛋白／ml）。再加人无菌双蒸水50μl，在DNA热循环仪上进行引物延伸与DNA扩增。阴性对照以每5μl细胞提取液加人1μg／μl无DNA酶的RNA酶，37℃孵育20min后，再做PCRELISA。实验参数如下：引物延伸，25℃20mim；端粒酶灭活，94℃5mim；扩增条件为：变性94℃30s，复性50℃30s，延伸72℃90s，共30个循环，再加入5μl扩增产物，在室温下孵育10mim，再加入225μl杂交液（含DIG标记的探针）混匀。取上述混合液，每孔100μl加人用亲和素预包被的微量反应板。300r／min摇床37℃培养2h。甩净杂交液，250μ1洗液每次30s洗3次，甩干。每孔加入抗 DIG－POD 100μl，再在37℃下300r／min摇床培养30min，甩净孔内液体，加入100μl TMB液（含DIG底物），在室温下显色l5 min。每孔加入100μl终止液，用DG5031型酶标分析仪以450m波长测量吸光值（A）。样品A值／阳性对照A值＞2．0为阳性。

3 统计学处理 用χ2检验进行统计学分析。χ2值用Person的检验公式计算，α值定为0．05。

结 果

各种病理类型肝癌组织端粒酶活性总阳性率为89．4% （42／47），明 显 高 于 非 癌 肝 组 织 （0／10，0．00%），二者比较具有高显著性差异（P＜0．01）。各种病理类型胃癌组织端粒酶活性总阳性率为85．0%（51／60），明显高于非癌胃组织（1／20，5．00%），二者比较具有高显著性差异（P＜0．01）。

表1 不同类型的肝癌组织与正常组织端粒酶活性阳性率

表2 不同病理类型的胃癌组织与正常组织端粒酶活性阳性率

讨 论

端粒（Telomere）是真核细胞染色体的末端结构，由DNA和端粒结合蛋白组成。端粒DNA由短的碱基序列多次重复组成，人类端粒DNA由TTAGGG序列重复约2000次而成。端粒具有稳定染色体结构，维持细胞正常寿命或决定细胞分裂次数等功能。1972年，诺贝尔奖获得者Watson提出了真核细胞必有一种机制来防止其端粒DNA随细胞分裂而不断丢失的问题，纽约冷泉巷分子生物学研究室的人员随即开始了这方面的研究，并于1978年搞清了四膜虫端粒DNA的一级结构，于1985年在四膜虫细胞提取液中发现了端粒酶［2］。端粒酶是一种具有逆转录功能的核糖蛋白酶，能以自身RNA为模板，以染色体3’末端DNA为引物延伸端粒DNA。该酶的发现，使Watson提出的问题得到了解答。1989年，Morin在来自人类恶性肿瘤的传代细胞系－－HeLa细胞中发现了端粒酶活性；继之，Counter等又在腹水转移的卵巢癌中检测到了端粒酶活性，引起了人们对端粒酶与细胞永生化和肿瘤发生关系的注意［3］。1994年，Kim等建立了检测端粒酶活性的TRAP法。TRAP法及由其衍生出的端粒酶PCR－ELISA法，具有高度敏感（可从只有10个细胞的标本中测出端粒酶活性），高度特异，和比较快速与简便等优点。近年来国内外的诸多研究发现，正常机体除生殖细胞及造血干细胞外，大多数细胞没有端粒酶活性，但端粒酶在约90%以上的恶性肿瘤中呈阳性，其活性的表达被认为是恶性肿瘤发生发展中的一个关键事件，是恶性肿瘤细胞得以无限增殖的必需条件［4～7］。

胃癌和肝癌是我国最常见的恶性肿瘤，分别为我国人口恶性肿瘤死亡原因之第2位和第3位，仅次于肺癌。众多研究表明，胃癌组织的端粒酶活性阳性率在76%～94%［8］；肝癌组织的端粒酶活性阳性率在80%～100%［9］。本文用PCR－ELISA法，对各种病理类型的肝癌和胃癌组织及非癌肝胃组织标本进行了端粒酶活性检测，结果发现，各种病理类型肝癌组织端粒酶活性总阳性率为89．4%，显著性地高于非癌肝组织；各种病理类型胃癌组织端粒酶活性总阳性率为85．0%，显著性地高于非癌胃组织。而不同类型肝癌组织的端粒酶阳性率之间和不同类型胃癌组织的端粒酶阳性率之间无显著性差异。因此，端粒酶活性检测不能用于肝癌和胃癌病理类型之区别，但可作为一种分子标记物而用于肝癌与胃癌的辅助诊断，亦可用于肝癌与胃癌和各种非癌性病变的鉴别诊断。

考参文献

［1］ 邓守恒，曾小华，曹凤军，等．硒化壳聚糖对NB4细胞增殖的影响及其与端粒活性和hTERT基因表达的关系［J］．陕西医学杂志，2010，39（3）：282－284．

［2］ 符兆英，刘晓斌，陈延伟．端粒酶与肿瘤关系研究进展［J］．中国现代医学杂志，2001，11（7）：34－36．

［3］ 符兆英，Matthews James．肝肿瘤与正常肝组织端粒酶活性检测［J］．陕西医学杂志，1999，28（4）：233－235．

［4］ 肖 冰，李建利，杨彦玲．胃癌组织端粒酶活性的表达及其临床意义［J］．陕西医学杂志，2008，37（11）：1523－1525．

［5］ Zhou Xi，Zhang Peng Hui．Stable inhibition of hTERT gene by siRNA in hepatocarcinoma cells ［J］．J Fourth Mil Med Univ，2005，26（24）：2233－2236．

［6］ Jaskelioff M，Muller FL，Paik JH，et al．Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase－deficient mice［J］．Nature，2011，469（7328）：102－106．

［7］ Lu Y，Gu J，Jin D，Gao Y，et al．Inhibition of telomerase activity by HDV ribozyme in cancers［J］．J Exp Clin Cancer Res，2011，30：1．

［8］ 高 枫，符兆英．特异性环氧合酶－2抑制剂SC236诱导胃癌细胞株凋亡的实验研究［J］．现代肿瘤医学，2009，17（8）：1423－1425．

［9］ 黄光琳．肝癌血清标志物研究进展［J］．陕西医学杂志，2010，39（12）：1681－1682．