黄芩苷对白血病细胞耐药株逆转耐药效果及机制研究

第四军医大学西京医院血液科（西安710032） 杨莉洁 赵 挺 白庆咸 董红娟

目前白血病的治疗大多采用联合化疗，尽管生存期已明显延长，但仍有逾30%的病人发生多药耐药而耐药细胞是否具有逆转作用及机制如何仍未有文献报道。本课题拟观察黄芩苷对人白血病耐药株K562／Adr的逆转作用并对其可能的机制进行初步探讨。导致化疗失败。多药耐药（Multidrug resistanee，MDR）已成为白血病化疗及白血病病人长期无病生存的主要障碍［1］。因此，寻找克服 MDR的治疗措施对白血病的治疗药物具有重大意义。目前MDR逆转剂主要存在的问题有效果不佳，部分逆转药物副作用较大等不足，研究报道，一些中药提取物对肿瘤的多药耐药具有逆转作用［2］，且此类药物毒副作用明显低于经典逆转剂，已逐渐成为MDR逆转剂筛选的热点。黄芩苷是由中药黄芩中提取出来的重要成分之一，有研究显示它可能具有逆转耐药的作用［3］，但其对白血病

材料与方法

1 细胞系 人白血病亲本细胞株K562为本实验室存留，耐药株细胞K562／Adr购于南京凯基生物公司。

2 主要试剂 黄芩苷（纯度95%）购于Sigma公司，逆转录试剂盒购于大连宝生物公司，Trizol购于Invitrogen公司。PCR Taq酶购于大连宝生物公司。

3 方 法

3．1 抑制率及逆转作用评价：取对数生长期的耐药细胞K562／Adr，细胞密度5×104／ml，接种于96孔板内，待细胞长到约80%汇合率时以倍比稀释的方法由高到低分别加入由含5、10μg／ml黄芩苷完全培养基配制的不同浓度的阿霉素（Adriamycin，Adr）（800、400、200、100、50μg／ml），另设空白对照组（细胞＋培养液）、调零孔（培养液），药物作用48h后，使用MTT法检测各组的抑制率：抑制率（%）（Inhibition rate，IR）＝（1－实验孔OD值／对照孔OD值）×100%；耐药指数（Resistance index，RI）＝IC50（耐药细胞）／IC50（亲本细胞）；逆转倍数（Reversal fold，RF）＝IC50（耐药细胞单用化疗药物）／IC50（耐药细胞联用化疗药物＋逆转剂）；相对逆转率（relative reversal rate，RRR）＝（IC50（耐药株单用化疗药）－IC50（耐药株化疗药＋逆转剂））／（IC50（耐药株单用化疗药）－IC50（亲本株单用化疗药）），RRR≥1代表完全逆转，RRR﹤1代表部分逆转。

3．2 K562／ADR细胞中ADR蓄积测定：收集对数生长期的K562／ADR细胞，以1×106／孔接种于6孔板，加入不同浓度黄芩苷，悬于含5μg／ml ADR的完全培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养2h后，用冰冷的PBS洗涤细胞2次，重悬于1ml冰冷的PBS中，立刻用流式细胞仪检测细胞内ADR的蓄积，每组各检测10 000个细胞。

3．3 MDR相关基因的检测：取对数生长期的K562／Adr，以0．25%的胰蛋白酶消化后形成细胞悬液，接种6孔板内，细胞密度5×105／ml，2ml／孔，待细胞长到约80%汇合率时以倍比稀释的方法由高到低分别加入由完全培养基配制的不同浓度的黄芩苷（10、5μg／ml），另设空白对照组（细胞＋培养液），药物作用48h后，TRizol法提取RNA，RT－PCR检测 MDR相关基因MDR1、MRP以及LRP基因的表达水平，以GAPDH为内对照，4个基因相应的PCR引物，见表1。

表1 目的基因引物序列

4 统计学方法 所有数据使用SPSS 17．0进行统计学分析，细胞增殖抑制率、IC50值比较采用两样本t检验，基因表达水平先采用Image J软件计算出灰度值，再采用t检验分析统计学差异。以P＜0．05为差异有显著性。

结 果

1 阿霉素对K562细胞和K562／Adr细胞的抑制作用：MTT结果显示Adr作用于K562／Adr耐药细胞的IC50值约为12．099μmol／ml，作用于 K562细胞的IC50值为0．696μmol／ml，K562／Adr细胞对阿霉素的敏感性显著低于K562细胞（P＜0．001），其耐药倍数为17．384倍（图1）。

图1 阿霉素对K562细胞和K562／Adr细胞的抑制作用

2 黄芩苷对K562细胞和K562／Adr细胞的抑制作用：MTT结果显示黄芩苷对K562亲本细胞及耐药细胞均具有抑制作用，对K562／Adr耐药细胞的IC50值约为16．223μg／ml，对K562细胞的IC50值仅为0．091μg／ml（图2）。

图2 黄芩苷对K562细胞和K562／Adr细胞的抑制作用

3 黄芩苷对K562／Adr细胞的逆转作用：黄芩苷（10μg／ml、20μg／ml）联合 Adr（0．5－12．8μmol／ml）（简称AB10组、AB20组）对K562／Adr的抑制率分别为（3．85%、6．39%、17．14%、34．26%、52．99%、70．53%和88．18%）以及（5．86%、11．38%、30．43%、51．13%、74．44%、88．75%和94．21%），联用黄芩苷后的IC50分别为2．859μmol／ml及1．549μmol／ml，较单用Adr具有显著性差异（P＜0．01，图3）。

图3 黄芩苷对K562／Adr细胞的逆转作用

RF（AB10）为4．230，RF（AB20）为7．812；RRR（AB10）及RRR（AB20）分别为0．81及0．93，黄芩苷（10μg／ml、20μg／ml）对 K562／Adr的耐药逆转为部分逆转作用。

4 黄芩苷对K562／Adr细胞内Adr蓄积的影响：0、10、20μg／ml黄芩苷分别与5μmol／ml Adr作用2h后，K562／ADR细胞内Adr的荧光强度分别为1．058±0．155、1．525±0．213和2．217±0．356，各剂量组之间存在显著性差异 （P＜0．05）（图4）。

5 黄芩苷对K562／Adr细胞 MDR1、MRP1以及LRP基因表达的影响：RT－PCR结果显示10μg／ml和20μg／m黄芩苷处理后，K562／Adr细胞中 MDR1以及MRP1mRNA的表达水平较对照组明显降低，其中以MDR1表达变化最为显著；LRP mRNA表达水平未见明显改变（图5）。因此，筛选安全有效的MDR逆转剂成为了肿瘤化疗研究的一大热门课题。

图5 黄芩苷对MDR1、MRP1以及LRP基因表达的影响

黄芩苷（Baicalin）是从唇形科植物黄芩中提取、分离出来的黄酮类化合物［4］，根据中医中药理论，黄芩具有解热、降压、利胆、保肝、镇静、抗菌等药理作用，而黄芩苷则是黄芩的一个重要有效成分［5］。由于该药物已广泛应用于临床，毒副作用较低，因此具有良好的MDR逆转剂前景。本课题选取白血病耐药细胞株，根据经典的MDR逆转实验对黄芩苷逆转白血病耐药细胞株MDR的效果进行了评估，并对其作用机制进行了初步的探讨。实验结果显示，黄芩苷对白血病耐药细胞株K562／Adr具有显著的逆转作用。在不直接引起细胞凋亡的浓度下（10、20μg／ml），黄芩苷可对白血病耐药细胞的MDR进行部分逆转，显著提高细胞内化疗药物的浓度。

讨 论

多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药后对其它结构、细胞靶点和作用机制不同的多种抗癌药物产生交叉耐药的现象。截至目前，肿瘤研究者发现了诸多MDR逆转剂，如最经典的钙通道阻滞剂维拉帕米，还有其它如钙调节蛋白抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、寡核苷酸、免疫抑制剂、甾体类激素等。但是这些具有逆转MDR作用的药物大多存在毒副作用较大的缺陷，限制了其在临床的进一步应用。

MDR的产生是多机制、多途径、多环节的过程，目前认为白血病细胞多药耐药的机制与ATP结合的盒式（ATP binding cassette，ABC）运输蛋白家族密切相关，该蛋白家族的主要成员包括：①P－糖蛋白（P－gp）介导的药物泵出；②MRP介导的药物泵出；③LRP介导的药物转运；④乳癌耐药蛋白BCRP的参与等。不同的药物泵化疗药的作用也不尽相同，例如P－gp主要泵出蒽环类、生物碱类药物，MRP转运多柔比星的作用更为明显，而LRP则与顺铂类药物耐药关系密切。为了探讨黄芩苷逆转作用的分子机制，我们采用RTPCR法检测了白血病耐药细胞株在黄芩苷处理后耐药相关基因的变化。实验结果显示黄芩苷可显著下调MDR1基因的表达，对MRP基因也有一定的抑制作用，但对LRP基因的影响不甚明显。这提示黄芩苷的MDR逆转作用可能主要在于抑制了耐药细胞中MDR1基因的表达。阿霉素属于抗生素类抗肿瘤药物，已有研究证实P－cp可将阿霉素泵出细胞外而导致MDR［6］，因此黄芩苷抑制MDR1基因的表达后肿瘤耐药细胞中的阿霉素蓄积水平升高，保证了药物的杀伤作用。

［1］ Norgaard JM，Hokland P．Biology of multiple drug resistance in acute leukemia［J］．Int J Hematology，2000，72（3）：290－297．

［2］ Efferth T，Davey M，Olbrich A．Activity of drugs from traditional Chinese medicine toward sensitive and MDR1－or MRP1－overexpressing multidrug－resistant human CCRF－CEM leukemia cells［J］．Blood Cells Molecules and Diseases，2002，28（2）：160－168．

［3］ 张慧珠，杨 林，任雷鸣，等．中药活性成分逆转肿瘤细胞多药耐药作用的体外筛选［J］．华北煤炭医学院学报，2003，5（3）：265－267．

［4］ 杨亚丽，吴 芳，杨瑞瑞．不同采收期黄芩HPLC指纹图谱比较研究［J］．陕西中医，2011，32（7）：901－902．

［5］ 张喜平，田 华，程琪辉．黄芩苷的药理作用研究现状［J］．中国药理学通报，2003，19：1212－1215．

［6］ Kanagasabai R，Krishnamurthy K，Druhan LJ，et al．Forced expression of heat shock protein 27（Hsp27）reverses P－Ggycoprotein（ABCB1）－mediated drug efflux and MDR1gene expression in adriamycin－resistant human breast cancer cells［J］．Journal of Biological Chemistry，2011，286（38）：33289－33300．