家兔C型利钠肽基因真核表达载体的构建及鉴定*

张 剑，龚昆梅，肖 乐，王昆华，欧阳一鸣，李临海，黄映光，朱 宇，龙亚新

(云南省第一人民医院普外一科，昆明 650032)

C型利钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是Sudoh等[1]在1990年从猪脑中分离而得的由22个氨基酸组成的多肽，是利钠肽家族的重要成员[2]，主要表达于中枢神经系统和血管内皮细胞。目前认为CNP是新型有效的血管调节因子[3]，但由于CNP在合成后并非大量释放入血，且半衰期极短(仅为2.6 min)，生理状态下血浆CNP浓度难以检出[4]，大大限制了对其功能的研究和应用。本研究利用基因工程技术将CNP基因导入真核表达载体中，是进一步基因治疗研究的重要基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌株 真核表达质粒pEGFP-N1由本室保存；感受态大肠杆菌DH5α购自北京百泰克生物技术有限公司；克隆载体pMD 18-T购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.1.2主要试剂和工具酶 限制性内切酶PstⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；逆转录酶M-MuLV购自加拿大Fermentas公司；TaqPlus DNA聚合酶、dNTP Mix、总RNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；质粒提取纯化试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司。

1.1.3PCR引物设计 利用软件Primer Premier 5.0辅助设计，由上海超世生物科技有限公司合成。序列如下：上游引物5′-ATG CAC CTC TCC CAG CTG C-3′，5端从起始密码ATG开始；下游引物5′-ACA TCC CAT GCC GCT CAT G-3′，5′端含有终止密码子TAG的互补序列。PCR产物长度为381 bp。

1.2方法

1.2.1兔腹主动脉总RNA的提取和cDNA的逆转录 按照总RNA提取试剂盒、Fermentas逆转录试剂盒说明书进行。

1.2.2兔CNP基因全长编码区的克隆 以兔腹主动脉cDNA为模板，用RT-PCR方法克隆。cDNA模板4 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，Taq plus buffer(10×)5 μL，Taq plus(5 μ/μL)2 μL，DMSO 2.5 μL，甘油2.5 μL，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10 μmol/L)2 μL，ddH2O 28 μL。循环条件为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 75 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s(共40个循环)，72 ℃延伸10 min。将产物经2％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.3pMD 18-T/rCNP的亚克隆 将CNP片段胶回收后通过TA克隆连接到克隆质粒pMD 18-T的TA克隆位点，经T/A连接，16 ℃延伸30 min。将重组克隆转化感受态大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆，扩增后提取纯化质粒，得到重组pMD 18-T /rCNP。

1.2.4pMD 18-T/rCNP的筛选和鉴定 用Pst Ⅰ内切酶对重组pMD 18-T/rCNP进行单酶切，筛选出负向插入片段，分别用HindⅢ和KpnⅠ双酶切鉴定。双酶切体系：10×M Buffer 5 μL，HindⅢ 2.5 μL，KpnⅠ 2.5 μL，模板20 μL，双蒸20 μL，共50 μL，37 ℃酶切1 h，结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5pEGFP-N1/rCNP的构建和鉴定 用HindⅢ和KpnⅠ分别对pEGFP-N1和负向pMD 18-T/rCNP进行双酶切，切胶回收后将CNP通过T4DNA连接酶定向克隆至pEGFP-N1的酶切位点HindⅢ和KpnⅠ中，转化感受态大肠杆菌DH5α，选取阳性克隆，扩增后提取纯化质粒，得到重组pEGFP-N1/rCNP。然后分别用PCR、双酶切和测序三重方法对重组pEGFP-N1/rCNP进行鉴定。

2 结 果

2.1家兔CNP基因全长编码区的克隆 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在381 bp左右的位置可见1条清晰明亮的目的条带，片段大小与Genebank中公布的片段大小相符。而阴性对照无目的条带出现，见图1。

1：DNA 标记物；2：目的条带家兔CNP；3：阴性对照。

2.2pMD 18-T/rCNP亚克隆的筛选和鉴定 用Pst Ⅰ对pMD 18-T /rCNP进行单酶切，含反向插入片段的酶切结果是2条分别为153 bp和2 920 bp的条带，含正向插入片段的酶切结果是2条分别为256 bp和2 817 bp的条带。

1：DNA 标记物；2：重组pEGFP-N1/CNP；3：空pEGFP-N1。

2.3pEGFP-N1/rCNP的鉴定 采用pEGFP-N1/rCNP为模板，进行PCR鉴定，在381 bp左右的位置可见到目的条带。用HindⅢ和KpnⅠ对重组pEGFP-N1/rCNP进行双酶切，结果得到大小分别为4 300 bp和400 bp的2条片段，而空pEGFP-N1仅为1条4 700 bp的片段(图2)。经Blast对比，测序结果与Genebank中公布的序列完全相符(Gene ID：100344147)，且目的片段被准确插入到pEGFP-N1中HindⅢ和KpnⅠ中(上海生工生物工程技术有限公司，07051844(ZJ1)PEGFPN5_A11)。重组pEGFP-N1/rCNP的部分测序结果，见封2图3。

3 讨 论

利钠肽家族成员包括心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)，脑利钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、CNP、树眼镜蛇属利钠肽(dendroaspis natriureticpeptide,DNP)、尿扩张素、鸟苷蛋白和尿鸟苷蛋白等[5]。利钠肽在调节血容量、血管平滑肌张力和维持心血管动态平衡方面起着重要作用[6]。其中，ANP和BNP主要来源于心脏，合成后分泌到血液循环中与血管组织、肾脏和肾上腺上的特异性受体(natriuretic peptide receptor,NPR)-A结合，发挥促使血管扩张、促进利钠、利尿等作用[7]；CNP主要来源于中枢神经系统、血管内皮和肾脏，通过旁分泌、自分泌的方式与NPR-B结合，对血管紧张度和重构起调节作用[8-9]。

CNP主要在血管组织中表达，与广泛分布于血管系统、脑、骨等组织的受体胞外区域特异性结合后，通过跨膜转运激活与质膜相连的鸟苷酸环化酶，促进第二信使cGMP积累，导致cGMP依赖蛋白激酶磷酸化，降低细胞内钙离子浓度，使血管平滑肌松弛[10]。其生理效应：(1)调节血管平滑肌细胞紧张度与血管内皮细胞保持一致，实现对局部血管舒缩的调控[11]；(2)调节血管稳态[12]，直接或间接调节血压[3,13]；(3)增强心肌收缩[14]；(4)抑制血管炎症反应和血管平滑肌细胞增殖[15]；(5)促进血管损伤后新生内膜形成[3,16]；(6)抑制缺血或再灌注损伤[4]以及作为血管内皮细胞超极化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor,EDHF)发挥作用[17]。

本研究直接通过RT-PCR方法从家兔血管组织中克隆CNP全长编码区，然而CNP编码区GC含量高达64％，容易形成稳定的二级结构，使PCR反应及测序常常不能顺利进行。本实验中采用提高预变性温度和延长变性时间的办法，同时加入甘油和二甲亚砜等PCR增强剂，保证了PCR扩增反应的顺利进行。

外源DNA片段与载体连接的方式包括同源黏端连接、平端连接和定向克隆，其中定向克隆具有连接效率高、定向插入和有效限制自身环化的优点[18]。本研究先将CNP全长编码区亚克隆至克隆载体pMD 18-T中，再通过双酶切使CNP片段具备与pEGFP-N1互补的黏端，然后再定向克隆至pEGFP-N1的转录起始位点下游。此方法与直接在引物末端添加酶切位点相比，大大提高了酶切和连接效率。

本研究成功构建了含家兔CNP基因的真核表达质粒，对于进一步开展研究CNP的作用机制以及与疾病的关系及其临床应用价值等打下了重要基础。

[1]Sudoh T,Minamino N,Kangawa K,et al.C-type natriuretic peptide(CNP):a new member of natriuretic peptide family identified in porcine brain [J].Biochem Biophys Res Commun,1990，168(2):863-870.

[2]Rubattu S,Sciarretta S,Valenti V,et al.Natriuretic peptides:an update on bioactivity,potential therapeutic use,and implication in cardiovascular diseases[J].Am J Hypertens,2008，21(7):733- 741.

[3]Scotland RS,Ahluwalia A,Hobbs AJ.C-type natriuretic peptide in vascular physiology and disease[J].Pharmacol Ther,2005,105(2):85-93.

[4]Hobbs AJ,Foster P,Prescott C,et al.Natriuretic peptide receptor-C regulates coronary blood flow and prevents myocardial is chemia/reperfusion injury:a novel cardioprotective role for endothelium-derived C-type natriuretic peptide[J].Circulation,2004,110(11):1231-1235.

[5]Potter LR,Yoder AR,Flora DR,et al.Natriuretic peptides:their structures receptors,physiologic,functions and therapeutic applications[J].Handb Exp Pharmacol,2009(191):341-366.

[6]Vlachopoulos C,Ioakeimidis N,Terentes-Printzios D,et al.Amino-terminal pro-C-type natriuretic peptide is associated with arterial stiffness,endothelialfunction and early atherosclerosis[J].Atherosclerosis,2010,211(2):649-655.

[7]Nakao K,Ogawa Y,Suga S,et al.Molecular biology and biochemistry of the natriuretic peptide system.I:Natriuretic peptides[J].J Hypertens,1992,10(9):907-912.

[8]Miyoshi M,Kitaqawa Y,Imoto T,et al.Effect of natriuretic peptide receptor antagonist on lipopolysaccharide-induced fever in rats:is natriuretic peptide an endogenous antipyretic[J].J Pharmacol Exp Ther,2006,318(3):1163-1170.

[9]Pagel-Langenickel I,Buttgereit J,Bader M,et al.Natriuretic peptide receptor B signaling in the cardiovascular system:protection from cardiac hypertrophy[J].J Mol Med(Berl),2007,85(8):797-810.

[10]Garbers DL,Chrisman TD,Wiegn P,et al.Membrane guanylyl cyclase receptors:an update[J].Trend s Endocrinol Metab,2006,17(6):251-258.

[11]Kelsall CJ,Chester AH,Sarathchandra P,et al.Expression and localization of C-type natriuretic peptide in human vascular smooth muscle cells[J].Vascular Pharmacol,2006,45(6):368-373.

[12]Potter LR,Abbey-Hosch S,Dickey DM.Natriuretic peptides,their receptors,and cyclic guanosine monophosphate-dependent signaling functions[J].Endocr Rev,2006,27(1):47-72.

[13]Ono K,Mannami T,Baba S,et al.A single-nucleotide polymorphism in C-type natriuretic peptide gene may be associated with hypertension[J].Hypertens Res,2002,25(5):727-730.

[14]Palmer SC,Prickett TC,Espiner EA,et al.Regional release and clearance of C-type natriuretic peptides in the human circulation and relation to cardiac function[J].Hypertension,2009,54(3):612-618.

[15]Walther T,Stepan H.C-type natriuretic peptide in reproduction,pregnancy and fetal development[J].J Endocrinol,2004,180(1):17-22.

[16]Hutchinson H,Trinlade P,Cunanan D,et al.Mechanisms of natriuretic-peptide-induced growth inhibition of vascular smooth muscle cells[J].Cardiovascular Res,1997,35(1):158-167.

[17]Sandow SL,Tare M.C-type natriuretic peptide:a new endothelium-derived hyperpolarizing factor[J].Trends Pharmacol Sci,2007,28(2):61-67.

[18]Sambrook J,Ffitsch EF,Maniatis T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual[M].3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor,2002:78-90.