急性子中 balsam inone A和 balsam inone B对人肺癌A 549细胞生长及周期的影响

裴 慧,钱士辉

中药急性子为凤仙花科 (Balsam inaceae)植物凤仙花 (ImpatiensbalsaminaL.)的干燥成熟种子[1],中国大部分地区均有分布,资源丰富。急性子具有破血软坚、消积的功效,其味微苦、性温,有小毒；入肝、脾经、降气行瘀,主治经闭、噎膈、腹部肿块、骨哽咽喉和外疡坚块[1]；临床上可用于避孕[2],终止早孕[3],食管贲门癌及梗阻、癌症、肿瘤[4],闭经和骨质增生等[5]。现代药理学研究表明：急性子具有促透皮、抗生育、抗肿瘤及抗菌等作用。

细胞异常增殖是恶性肿瘤的生物学特征之一,检测药物是否影响肿瘤细胞的增殖活性通常是筛选抗肿瘤药物的主要方法。M TT法(噻唑蓝法)是最为常用的方法之一,该法灵敏度高,线性关系好,简便、经济、快速,广泛应用于大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等方面[6]。

作者以人肺癌A 549细胞株为实验对象,对从急性子中分离得到的双萘呋喃 -7,12-酮类化合物balsam inone A和 balsam inone B体外抑制肿瘤细胞生长的作用以及对细胞周期的影响进行研究,以期为抗肿瘤中药的开发和临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人肺癌A 549细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

急性子购自江苏省盱眙县中药饮片厂,经江苏省中医药研究院钱士辉研究员鉴定为凤仙花的干燥成熟种子。采用体积分数 80％和 60％乙醇加热回流提取,并经溶剂萃取、D 101大孔树脂富集、硅胶柱层析、Sephadex LH-20和ODS柱层析以及重结晶等方法获得提取物,再经1H-NMR、13C-NMR、M S、IR和UV等方法鉴定结构,并参照文献[7]的数据鉴定提取物为balsam inone A和 balsam inone B,经 HPLC检测纯度均大于98％。临用时用DM EM培养液分别配制成不同浓度备用,其中DM SO终浓度小于体积分数0.5％。

主要试剂包括：DM EM完全培养基(美国 GIBCO公司,批号：450542)、新生牛血清 (兰州民海生物工程有限公司,批号：080508)、M TT(美国AMRESCO公司,批号：0793)、胰酶 (美国 AMRESCO公司,批号： 0458)、碘化吡啶(PI染液,美国 Sigm a公司)、核糖核酸酶 (美国 Sigm a公司 )、TritonX-100(美国AMRESCO公司,批号：010T0405)、DM SO(美国AMRESCO公司,批号：019D 0404)和 5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司,批号：0710052)。

主要仪器包括：HERA Cell 150 CO2细胞培养箱(美国 Thermo Fisher Scientific Inc.)、CKX31 SF倒置相差显微镜(日本OLYM PUS公司)、Thermo Scientific M u ltiskan Spectrum全波长酶标仪 (美国 Thermo Fisher Scientific Inc.)、MH-1403平板振荡器 (江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)和 FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将A 549细胞接种在含体积分数10％灭活小牛血清的 DM EM完全培养基上,置于温度 37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。细胞呈单层生长,当细胞单层面积长至培养瓶瓶底面积70％～80％时传代。实验均在细胞对数生长期进行。

1.2.2 细胞生长抑制率的测定 采用M TT法[8]测定A 549细胞的生长抑制率。取对数生长期的A 549细胞,用质量体积分数 0.25％胰酶和质量体积分数0.02％EDTA混合消化液消化,用含体积分数 10％灭活小牛血清的DM EM完全培养基将细胞密度调整至5×104mL-1,接种到 96孔培养板中,每孔 100μL细胞悬液；继续培养 24 h后,吸弃培养液；处理组分别添加含不同浓度 balsam inoneA和 balsam inoneB的培养液 90μL至终浓度为 20、40、60和 80μmol·L-1,阴性对照添加含 PBS的 DM EM完全培养基 90μL,阳性对照添加含 5-氟尿嘧啶的DM EM完全培养基90μL至最终质量浓度 100m g·L-1；每处理及阴性、阳性对照均设 6个复孔,并设空白调零孔；继续培养48 h,每孔加入 5 g·L-1M TT 10μL；继续培养 4 h,吸弃上清液,每孔加入100μL DM SO,振荡 10m in,溶解结晶；用酶标仪测定波长570 nm处的吸光值(A),实验重复3次。计算A 549细胞的生长抑制率,公式为：生长抑制率 =〔(A阴性对照-A用药)/A阴性对照〕×100％。

1.2.3 细胞周期检测 取对数生长期的A 549细胞制成单细胞悬液,调整细胞密度至 1×105mL-1,接种于 6孔板中,每孔 2mL细胞悬液；培养 24 h后,处理组分别添加含不同浓度 balsam inone A和B的培养液2mL至终浓度为 20、40、60和 80μmol·L-1,对照组添加含体积分数10％灭活小牛血清的DM EM完全培养基 2mL,重复 3次；培养 48 h后分别收集细胞,并于 1 500 r·m in-1离心 5m in,PBS洗涤后,经 300目尼龙网过滤,调整细胞密度至 1×106mL-1；加入由50mL·L-1PI和 25m g·L-1RNase A组成的染液 1 mL,4℃避光染色 30m in后采用流式细胞仪检测,参照文献[9]的方法分析A 549细胞的周期。

1.3 数据统计处理

采用 SPSS 15.0统计软件对数据进行单因素方差分析,P＜0.05表示有统计学差异。用M odfit软件对荧光强度进行分析,并据此计算出DNA合成前期、DNA合成期和DNA合成后期细胞的比例。

2 结果和分析

2.1 对A549细胞的生长抑制作用

采用M TT法检测不同浓度 balsam inone A和 B对人肺癌 A 549细胞的生长抑制作用,结果见表 1。与阴性对照组相比,20、40、60和 80μmo l·L-1balsam inone A和 B对 A 549细胞生长有显著抑制作用 (P＜0.05),各处理组的吸光值均显著低于阴性对照组；且随着二者浓度的提高,对 A 549细胞的生长抑制率均呈逐渐增加的趋势,这一作用具有明显的量效关系。但各处理组的吸光值均大于阳性对照组(100m g·L-15-氟尿嘧啶),其中,balsam inone B各处理组的吸光值与阳性对照组有较大差异,而 20和40μmol·L-1balsam inone A处理组的吸光值与阳性对照组也有较大差异,但 60和 80μmo l·L-1balsam inone A处理组的吸光值与阳性对照组的差异较小。由生长抑制率可见：各处理组对A 549细胞的生长抑制率均低于阳性对照组,其中 20、40、60、80 μmo l·L-1balsam inone B处理组和 20、40μmo l·L-1balsam inone A处理组的生长抑制率与阳性对照组差异较大,而 60和 80μmol·L-1balsam inone A对A 549细胞的生长抑制率接近阳性对照组。

表 1 不同浓度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B对人肺癌A549细胞的生长抑制作用(±SD)1)Tab le 1 The grow th inh ib ition effect of d ifferen t concen tra tion s of ba lsam inone A and ba lsam inone B on hum an lung cancer A 549 cell (±SD)1)

表 1 不同浓度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B对人肺癌A549细胞的生长抑制作用(±SD)1)Tab le 1 The grow th inh ib ition effect of d ifferen t concen tra tion s of ba lsam inone A and ba lsam inone B on hum an lung cancer A 549 cell (±SD)1)

1)CK1：阴性对照 Negative contro l；CK2：阳性对照 (100m g·L-1 5 -氟尿嘧啶)Positive con tro l(100m g·L-1 5-FU).＊：与阴性对照相比差异显著 (P＜0.05)Significant difference compared w ith the negative control(P＜0.05).

处理Treatment浓度/μmo l·L-1 Concentration A570生长抑制率/％ Grow th inhibition rate CK1 - 1.379±0.701 -CK2 - 0.305±0.026＊ 77.882 Balsam inone A 20 0.692±0.043＊ 49.819 40 0.423±0.036＊ 69.326 60 0.351±0.008＊ 74.547 80 0.328±0.041＊ 76.215 Balsam inone B 20 0.617±0.053＊ 55.257 40 0.605±0.031＊ 56.128 60 0.551±0.007＊ 60.044 80 0.532±0.020＊ 61.421

2.2 对A549细胞周期分布的影响

人肺癌A 549细胞的细胞周期特点是细胞群分布于细胞的各个时期。经不同浓度 balsam inone A和B处理后A 549细胞各时期的比例见表 2。

表 2 不同浓度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B对人肺癌 A 549细胞周期分布的影响(±SD)1)Tab le 2 Effectsof d ifferen t concen tra tions of ba lsam inone A and ba lsam inone B on d istr ibu tion of cycle of hum an lung cancer A 549 cell(± SD)1)

表 2 不同浓度 ba lsam inone A和 ba lsam inone B对人肺癌 A 549细胞周期分布的影响(±SD)1)Tab le 2 Effectsof d ifferen t concen tra tions of ba lsam inone A and ba lsam inone B on d istr ibu tion of cycle of hum an lung cancer A 549 cell(± SD)1)

1)G0/G1：DNA合成前期 DNA p resynthesisphase；S：DNA合成期DNA synthesisphase；G2/M：DNA合成后期DNA postsynthesisphase.＊：与各自的对照相比差异显著(P＜0.05)Significantdifference compared w ith the respective control(P＜0.05).

处理Treatm en t浓度/μmol·L-1 Concentration比例/％ Proportion G0/G1 S G2/M对照CK - 82.393±1.764 13.108±1.255 4.498±0.592 Balsam inone A 20 75.785±3.696＊ 17.483±2.411 6.733±1.366 40 74.427±6.014＊ 17.750±4.627＊ 7.820±2.415＊60 74.485±4.466＊ 18.553±2.809＊ 6.960±2.312 80 74.380±6.226＊ 16.713±3.740 8.905±2.573＊对照CK - 82.091±2.015 14.152±2.698 3.753±2.797 Balsam inone B 20 78.643±2.393 17.903±0.080＊ 3.913±2.800 40 77.493±2.955 19.090±0.635＊ 3.417±2.503 60 75.467±3.147＊ 20.713±1.832＊ 3.863±1.386 80 74.740±2.681＊ 21.417±1.381＊ 3.843±1.519

20、40、60和 80μmol·L-1balsam inone A作用于A 549细胞 48 h后,各处理组 DNA合成前期 (G0/G1期)的细胞比例均较对照显著减少 (P＜0.05)；DNA合成期 (S期)的细胞比例均较对照有所增加,其中, 40和 60μmo l·L-1balsam inone A处理组与对照差异显著；DNA合成后期(G2/M期)的细胞比例也均较对照有所增加,其中,40和 80μmo l·L-1balsam inone A处理组与对照差异显著。研究结果表明：balsam inone A作用于A 549细胞,但无明显的量效关系。

20、40、60和 80μmo l·L-1balsam inone B作用于A 549细胞 48 h后,各处理组 G0/G1期的细胞比例均较对照减少,其中,60和 80μmo l·L-1balsam inone B处理组与对照差异显著；S期的细胞比例均较对照显著增加；各处理组 G2/M期的细胞比例与对照差异不大,但 20、60和 80μmo l·L-1balsam inone B处理组较对照小幅增加,而 40μmo l·L-1balsam inone B处理组较对照小幅减少。研究结果表明：balsam inone B作用于A 549细胞的 G0/G1期和 S期,且有明显的量效关系。

3 讨 论

恶性肿瘤细胞异常增殖是其生物学特征之一,而肿瘤的发生是细胞增殖与细胞凋亡相互拮抗的最终结果,由于细胞凋亡的存在,拮抗了细胞的加速增殖,维持细胞自身稳定,在临床上常通过各种方法和手段诱发肿瘤细胞发生凋亡,从而达到治疗肿瘤目的。

本文的研究结果表明：从急性子中分离得到的balsam inone A和 balsam inone B对人肺癌 A 549细胞的生长均具有较为显著的抑制作用,其生长抑制率随2个化合物浓度的提高而增强,具有明显的量效关系。但这 2个化合物对A 549细胞生长的抑制作用低于常用的药物 5-氟尿嘧啶,推测其原因与化合物浓度、抑制作用的机制等多种因素有关,有待进一步的研究证实。

供试的 2个化合物对人肺癌A 549细胞周期均有影响。balsam inone A能导致 A 549细胞DNA合成前期(G0/G1期)的细胞比例减少、DNA合成期(S期)和DNA合成后期 (G2/M期)的细胞比例增加,说明balsam inone A主要是将人肺癌A 549细胞的生长周期阻滞在 S期和 G2/M期,从而抑制 A 549细胞生长。balsam inone B则能导致A 549细胞中 G0/G1期的细胞比例减少、S期的细胞比例增加,且这一作用具有明显的量效关系,而对 G2/M期细胞则无明显作用,说明balsam inone B主要是将A 549细胞的生长周期阻滞在S期,阻止细胞进入 G2/M期,从而抑制 A 549细胞的生长。推测这 2个化合物对人肺癌A 549细胞不同的作用机制可能与 balsam inone A结构中包含羟基而balsam inone B结构中包含葡萄糖苷基有关。balsam inoneA和B对A 549细胞周期的影响机制可能是影响细胞周期蛋白的合成,也可能是通过其他途径影响基因表达,其作用机制还有待进一步研究。

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