藤稔葡萄花发育相关基因启动子的克隆及功能分析

张 睿，陶建敏，蔡斌华，章 镇

（南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095）

基因的表达有着严格的时间及空间顺序。开花诱导调控普遍存在于高等植物中，当植物生长到一定时期后，在外界适宜环境条件的诱导下启动自身发育程序，由营养生长转入生殖生长。FT（FLOWERING LOCUS T）、AP3（APETALLA3）、AG（AGAMOUS）和FLC（FLOWERING LOCUSC）是调控成花时间及花器官原基分化与发育的关键基因。FT基因为重要的成花转变信号，是多个成花途径的交汇作用基因［1］，FT与SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1）基因的表达均可被光周期途径正向调控，且FT可通过CO（CONSTANS）基因调节SOC1的表达［2］。FLC基因是调控春化作用需求和响应的关键基因之一，是具有抑制成花转变作用的MADS-box转录因子［3］，可直接阻遏FT和SOC1的表达［4］，且FLC的表达与多种正负调节因子紧密相关；春化作用可减弱FLC对成花的抑制能力，FRI（FRIGIDA）及FRI类似基因均可增强FLC的抑制作用［5］；FLC的作用部分依赖于另一 MADS蛋白 SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）［6］，自主途径也可通过下调FLC基因表达促进成花［7］。AP3基因在启动花瓣和雄蕊发育程序中有着B类基因的功能，并在花的第2轮和第3轮器官发育中表达。AG基因在雄蕊和心皮的发育中起C类基因的作用［8］，可能在花发育后期表达，并直接调控细胞内特异基因的表达。

启动子（promoter）是一段提供RNA聚合酶特异识别和结合位点的DNA序列，可控制基因转录的起始时间和表达程度，通常位于基因转录起始位点近端的核苷酸序列上游区域内，主要由核心启动区、上游元件和应答元件组成［9］。启动子通过选择性影响目的基因的转录水平来调节基因的表达量，并可限定基因在特定时空条件下的表达，在基因工程中具有广阔的应用前景。

基于热不对称交错式 PCR的基因组步移法（SEFA-PCR，self-formed adaptor PCR）具有高效经济的特点，仅需2条特异的巢式引物和1条部分随机引物即可进行PCR扩增；其特殊的热循环程序有利于特异产物的扩增，并抑制随机引物产生的非特异产物。此方法由Wang等［10］通过对TAIL-PCR技术［11］的改良而产生，具有较高的灵敏度和特异性，在高等植物的相关研究中已有应用这一技术克隆启动子的报道。杨国栋［12］利用 TAIL-PCR技术，从棉花（Gossypium spp.）基因组中克隆到长度为1610 bp的 GhNHX1基因启动子片段；李娜等［13］采用SEFA-PCR法克隆获得灵芝鳖烯合酶基因启动子；欧阳翔等［14］通过SEFA-PCR方法，扩增得到灵芝漆酶基因起始密码子上游长832 bp的启动子序列，该启动子区域除分布有基本的转录起始元件外，还存在多个潜在的顺式作用元件序列位点。SEFA-PCR反应对DNA模板质量要求不高，适宜的热循环程序是其获得特异目标产物的关键。采用该方法扩增获得的片段长度通常大于2 kb，是一种有效的启动子克隆手段。

目前，葡萄（Vitis vinifera L.）中FT、FLC、AP3和AG基因已被克隆，但关于这4个基因启动子克隆及功能分析的报道尚不多见。作者采用SEFA-PCR法，从藤稔葡萄（V.vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’）基因组中克隆这4个基因的启动子序列，并对FT、FLC和AP3启动子进行序列分析和顺式调控作用元件及功能预测，以期为进一步深入研究这些基因的表达调控模式提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试的藤稔葡萄新鲜幼嫩叶片采自南京农业大学沧波门实验基地。

LA Taq DNA聚合酶、10×LA buffer、MgCl2、d NTPs mixture、pMD19-T载体连接试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Axyprep1 kb DNA marker及Axyprep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α为本实验室保存的菌株；PCR引物合成及PCR产物测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

所用仪器有DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）、BioPhotometer plus核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf公司）、凝胶成像系统FR-200紫外与可见分析装置（上海复日科技有限公司）和BIORAD mylyder梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因组总DNA的提取及检测方法 采用改良CTAB法［15］提取基因组总DNA，实际操作过程略有改动。取约200 mg样叶，于液氮中研成粉末，加入1 mL65℃预热的提取缓冲液〔含1.4 mol·L-1NaCl、0.1 mol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH8.0）、质量体积分数2％CTAB和20mmol·L-1EDTA，使用前加入体积分数2％ β-巯基乙醇〕，混匀后于65℃水浴保温50 min，期间上下轻轻颠倒2～3次，4℃、12000 r·min-1离心10 min；上清液加入等体积三氯甲烷，充分混合后于4℃、12000 r·min-1离心10 min；上清液加入等体积V（苯酚）∶V（三氯甲烷）=1∶1的混合液，充分混合，于4℃、12000 r·min-1离心10 min；上清液加入0.8倍体积三氯甲烷抽提1次，于4℃、12000 r·min-1离心10 min；向上清液中加入1/10体积的3 mol·L-1乙酸钠（pH5.2）和2倍体积预冷的无水乙醇，混合均匀后置于-20℃冰箱中静置30 min沉淀DNA，于4℃、12000 r·min-1离心10 min，弃上清液；用体积分数75％乙醇洗涤沉淀3次，将沉淀干燥后加入30μL双蒸水，溶解后即为总DNA溶液。

取2μL总DNA溶液，用含有溴化乙锭（EB）的质量体积分数1％的非变性琼脂糖凝胶进行电泳检测。取1μL总DNA溶液，加入49μL双蒸水，用核酸蛋白测定仪检测DNA纯度。

1.2.2 引物设计和PCR扩增条件 根据本实验室克隆获得的藤稔葡萄FT、FLC、AP3及AG基因cDNA序列（GenBank登录号分别为 HM192810、HM192809、HM192808和HM192807），参照Wang等［10］的方法为每个基因设计2条巢式引物和1条部分随机引物，引物名称及序列详见表1。

表1 用于藤稔葡萄花发育相关基因启动子克隆的引物序列Table1 Primer sequences used for cloning of promoters of flower development related genes of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’

参照文献［10］采用SEFA-PCR法进行PCR扩增，2轮反应体系的总体积均为30μL。

第1轮PCR反应体系包括10×LA buffer3μL、0.25 mol·L-1MgCl23μL、0.25 mol·L-1d NTPs mixture5μL、5 U·μL-1LA Taq DNA聚合酶0.3μL、DNA模板1.5μL（约1μg）和10μmol·L-1引物SP30.5μL，用双蒸水补足至30μL。反应程序为：94℃90 s、30℃3 min；以0.2℃·s-1的速率缓慢升温至70℃，保持5 min；加入10μmol·L-1引物SP11.5 μL，继续进行PCR反应。反应程序为94℃30 s、70℃5.5 min，运行25个循环；94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、55℃30 s、70℃5 min，运行10个循环。

第2轮PCR反应体系包括10×LA buffer3μL、0.25 mol·L-1MgCl23μL、0.25 mol·L-1d NTPs mixture5μL、5 U·μL-1LA Taq DNA聚合酶0.3μL、10μmol·L-1引物SP21.5μL和稀释10倍的第1轮PCR反应产物1μL，用双蒸水补足至30μL。扩增反应程序为94℃30 s、68℃5.5 min，运行30个循环；94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、66℃30 s、70℃5 min，运行10个循环；94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、70℃5 min、94℃30 s、55℃30 s、70℃5 min，运行10个循环。

1.2.3 目的基因片段的回收及克隆 用含有EB的质量体积分数1％的非变性琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳，切下目的基因片段，按Axyprep DNA凝胶回收试剂盒的操作说明回收DNA。将目的基因片段与pMD19-T载体连接，并转化到大肠杆菌DH5α中，经Amp筛选，随机挑选PCR阳性克隆进行测序。

1.3 序列分析

将获得的核酸序列在NCBI（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov）上用 BLASTn进行序列相似性分析。应用在线植物转录元件分析工具PlantCARE对获得的启动子序列进行分析，寻找转录因子结合位点（TFBS，transcription factor binding site）。

2 结果和分析

2.1 SEFA－PCR扩增产物的凝胶电泳结果分析

采用SEFA-PCR方法获得的藤稔葡萄基因组总DNA第1轮和第2轮PCR扩增产物的凝胶电泳图谱见图1。由图1-a可见：除AG基因没有扩增出明显条带外，其他3个基因均扩增出特异条带，有的甚至还有多条带。由图1-b可见：AP3、FT和FLC3个基因均扩增出单一且特异的目的条带，且长度均大于1000 bp；AG基因也能扩增出条带，但条带呈弥散状，没有特异条带，因而无法回收用于序列分析及顺式调控作用元件预测。

图1 藤稔葡萄花发育相关基因启动子SEFA－PCR第1轮和第2轮扩增产物的电泳图谱Fig.1 Electrophoretogram of the first and the second round amplification products of SEFA-PCR of promoters of flower development related gene of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’

2.2 序列分析及顺式调控作用元件和功能预测结果

藤稔葡萄3个花发育相关基因FT、FLC和AP3的启动子序列的GenBank登录号分别为HM192806、HM192805和HM192804，且均包含多种具有不同功能的顺式调控作用元件。

FT片段长1605 bp，包含基因区域135 bp和实际启动子区域1470 bp，其中，FT启动子区序列与葡萄基因组序列（AM459941）的相似性为97％。经PlantCARE在线预测的FT启动子区顺式调控作用元件及功能见表2。FT启动子区片段包含参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控作用元件、真菌刺激响应元件、参与玉米蛋白代谢调控的顺式调控作用元件、参与干旱诱导的MYB结合位点、参与植物生长素响应的顺式调控作用元件、参与胚乳表达的顺式调控作用元件以及与花分生组织特定激活有关的顺式调控作用元件及多个光响应元件等，说明藤稔葡萄FT基因的表达可能受茉莉酸甲酯、玉米蛋白代谢、MYB、植物生长素、真菌刺激、干旱和光调控，并可能在花的分生组织和胚乳中表达。

FLC片段长1788 bp，包含基因区域90 bp和实际启动子区域1698 bp，其中，FLC启动子区序列与葡萄基因组序列（AM444662.2）的相似性为96％。经PlantCARE在线预测的FLC启动子区顺式调控作用元件及功能见表3。FLC启动子区片段包含参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控作用元件、参与脱落酸和VP1响应的顺式作用元件、厌氧诱导必需的顺式调控作用元件、MYB结合位点、真菌刺激响应元件、参与昼夜节律控制的顺式调控作用元件、光响应元件及与花分生组织表达有关的顺式调控作用元件等，说明藤稔葡萄FLC基因的表达可能受茉莉酸甲酯、脱落酸、MYB、VP1、厌氧诱导、昼夜节律、真菌刺激和光调控，并可能在花的分生组织中表达。

AP3片段长1143 bp，包含基因区域82 bp和实际启动子区域1061 bp，其中，AP3启动子区序列与葡萄基因组序列（AM469149.1）的相似性为100％。经PlantCARE在线预测的AP3启动子区顺式调控作用元件及功能见表4。AP3启动子区片段包含赤霉素响应元件、真菌刺激响应元件、参与干旱诱导的MYB结合位点、参与脱落酸响应的顺式作用元件、参与水杨酸响应的顺式作用元件、MYBHv1结合位点、光响应元件、胚乳表达所需的顺式调控作用元件及与花分生组织特定激活有关的顺式调控作用元件等，说明藤稔葡萄AP3基因的表达可能受赤霉素、真菌刺激、脱落酸、水杨酸、MYB、MYBHv1、干旱诱导和光调控，并可能在花的分生组织及胚乳中表达。

表2 应用PlantCARE在线预测的藤稔葡萄花发育相关基因FT启动子区的顺式调控作用元件及功能Table2 The cis-acting regulatory elements and functions of promoter region in flower development related gene FT of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

表3 应用PlantCARE在线预测的藤稔葡萄花发育相关基因FLC启动子区的顺式调控作用元件及功能Table3 The cis-acting regulatory elements and functions of promoter region in flower development related gene FLC of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

续表3 Table3（Continued）

表4 应用PlantCARE在线预测的藤稔葡萄花发育相关基因AP3启动子区的顺式调控作用元件及功能Table4 The cis-acting regulatory elementsand functions of promoter region in flower development related gene AP3 of Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujim inori’by PlantCARE on-line prediction

3 结 论

植物成花过程中存在多种成花诱导途径，在拟南芥〔Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.〕等模式植物中FT基因是光周期诱导途径的核心基因之一［16］。潘才博等［17］推测：菊花〔Dendranthema morifolium（Ramat.） Tzvel.〕的花发育相关基因FT主要与光周期敏感性密切相关，可能在光周期诱导途径中具有促进开花的作用。Kong等［18］认为：FT的2个同源基因GmFT2a和GmFT5a的表达量在短日照条件下被高度上调，并诱导大豆〔Glycinemax（L.）Merr.〕开花。

尽管目前没有证据表明葡萄存在经典的成花途径（如春化作用和光周期等），但葡萄中仍存在相关途径的调控基因，如FT和FLC等，这些基因在葡萄成花过程中的作用有待深入研究。藤稔葡萄的FT、FLC和AP3基因启动子序列片段中均存在多种诱导响应元件，可能均为诱导型启动子；3个基因的表达均受光调控，且均与真菌刺激和MYB相关。

藤稔葡萄花发育相关基因FT、FLC和AP3的启动子中均含有不同的组织特异表达元件，FT、FLC和AP3均可能在花的分生组织中表达，而FT和AP3还可能在胚乳中表达。Fumie等［19］从Citrus种子中分离出1个FT/TFL1的同源基因CuMFT1，并在成熟种子中检测到该基因的高量表达，经克隆获得2.4 kb的CuMFT1基因5′端上游片段，通过序列分析和转化拟南芥证实其具有种子特异启动子活性。本研究结果在一定程度上印证了这一结果。

虽然通过对藤稔葡萄花发育相关基因启动子进行序列分析判断出一些顺式调控作用元件，为最终了解这些基因的表达调控模式提供了依据，但若需全面了解这些元件在转录过程中的调节作用，还有待更进一步的深入研究。

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