石蒜核糖体蛋白L21的基因克隆及氨基酸序列分析

佟金凤，汪 仁，李晓丹，江玉梅，彭 峰，夏 冰

〔江苏省·中国科学院植物研究所（南京中山植物园）江苏省植物迁地保护重点实验室，江苏 南京 210014〕

核糖体是细胞进行蛋白质合成的重要场所，通过解码mRNA，与tRNA协同作用合成相应的蛋白质。一般来说，真核生物的核糖体为80S，由40S和60S2个亚基组成，含3～4种RNA和80多种蛋白质［1］。核糖体组装过程可分为3步：首先在细胞质中合成核糖体蛋白并运送到细胞核内；在核仁内，核糖体蛋白与rRNA组装成核糖体；组装完成的核糖体被运送到细胞质中，经过后期加工形成成熟的具有功能的核糖体［2-4］。研究结果表明：很多核糖体蛋白除具有组成核糖体和参与蛋白质生物合成的功能外，还具有参与复制、转录加工、翻译调控、DNA修复、耐药性形成、自体翻译、调控细胞凋亡和正常细胞的恶性转化及发育调控等作用［5-7］。核糖体蛋白L21（RPL21）是位于真核生物60S亚基上的蛋白质，其具体功能迄今为止仍未得到很好的阐释，目前已在GenBank登录的RPL21超过千条，主要来源于动物和微生物，来源于植物尤其是高等植物的RPL21尚不多见。

石蒜〔Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.〕体内所含的加兰他敏可用于治疗阿尔茨海默氏病和小儿麻痹症等疾病［8］。目前，有关石蒜的研究较多，作者所在课题组对石蒜也进行了遗传多样性分析、cDNA文库建立及总RNA提取方法等方面的研究［9-11］，但对石蒜RPL21尚无研究报道。作者根据来源于其他植物的已知RPL21的氨基酸序列，借助生物信息学技术和PCR技术筛选cDNA文库的方法扩增石蒜RPL21基因的cDNA序列，并对扩增序列进行测序分析，以期为石蒜RPL21及其基因的功能研究提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

实验所用的石蒜叶片全长cDNA文库为本实验室采用发芽20 d的石蒜嫩叶建立的cDNA文库［10］；供试的宿主菌为大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，质粒为pDNR-LIB。

实验用 TRIzol○RReagent购自 Invitrogen公司；DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、pMD18-T Vector和所有限制性内切酶均购自Takara公司；DNA纯化回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

实验仪器有AIR TECH超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司生产）、PCR仪（德国Eppendorf公司生产）、电热恒温隔水式精密培养箱（上海天恒医疗器械有限公司生产）、全温振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂生产）、PB303-S电子精密天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司生产）和79HW-1恒温磁力搅拌器（金坛市荣华仪器制造有限公司生产）。

1.2 方法

参考GenBank中已经公布的下列植物的RPL21基因的保守序列设计引物，包括拟南芥〔Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.〕AtL21（登录号NM_100831）、大麦（Hordeum vulgare L.）HvL21（登录号AK252012）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）MtL21（登录号BT051422）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）EgL21（登录号 EU284979）、毛 竹（Phyllostachys heterocycla‘Pubescens’）PeL21（登录号FP099981）、水稻（Oryza sativa L.）OsL21（登录号AF093630）、高粱〔Sorghum bicolor（L.）Moench〕SbL21（登录号XM_002468489）、小麦（Triticum aestivum L.）TaL21（登录号AF475114）以及玉米（Zea mays L.）ZmL21（登录号EU976390）。获得的1对 PCR引物中，上游引物序列为5′-GTTAACGGCGCCGTCCACAAG-3′；下游引物序列为5′-CATGTGCAGCCTTCAAGATGC-3′。

随机选取保存于-75℃超低温冰箱中的石蒜叶片全长cDNA文库，用灭菌的LB液体培养基将原始菌液（OD600=1.2）依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的菌液，分别取各级菌液2μL，均匀涂抹在含质量浓度30μg·mL-1氯霉素的LB固体培养基上，封口膜封口后于37℃恒温条件下倒置培养过夜（或16 h）；随机挑取分散均匀的单菌落，利用RPL21引物进行菌落PCR检测。PCR反应结束后，用质量体积分数1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，PCR产物上样量为4μL。将PCR检测为阳性的克隆交由上海英骏生物技术有限公司进行测序，结合序列对比方法，获得该克隆的全长cDNA序列。

PCR反应体系的总体积为10μL，包括0.5μL菌液（即模板DNA）、2.5 mmol·L-1上游和下游引物各0.5μL、10×PCR buffer（含25 mmol·L-1MgCl2）1.0 μL、2.5 mmol·L-1d NTPs0.8μL、5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2μL和6.5μL双蒸水。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；然后于94℃变性30 s、55℃退火1.5 min、72℃延伸1 min，共33个循环反应；最后于72℃延伸10 min。PCR扩增产物于-20℃冰箱中保存、备用。

1.3 序列分析

检测并去除所测序列两端的载体序列（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html），通过开放阅读框寻找并分析新基因的阅读框（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），核酸和氨基酸序列同源性采用DNAMAN软件（Version5.2.2.9）进行分析，并用ClustalX1.8和PhyloDraw V0.82软件进行系统树分析。采用ProtParam程序（http:∥www. expasy.org/tools/protparam.html）分析石蒜RPL21的氨基酸组成，并用ProtScale程序（http:∥www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析石蒜RPL21的疏水性。采用Psort程序（http:∥www.psort.org）进行石蒜RPL21的亚细胞定位分析。

2 结果和分析

2.1 石蒜核糖体蛋白L21基因全长cDNA序列分析

通过对筛选的阳性克隆进行测序，并删除载体序列及引物序列。获得的石蒜核糖体蛋白L21基因的全长cDNA序列见图1。该序列已登录在GenBank中，登录号为FJ972626，命名为LrRPL21。将LrRPL21的基因序列在NCBI提供的基因库中进行序列同源性检索，通过BLASTn分析，确定该基因的长度为709 bp，包含53 bp的5′非编码区、161 bp的3′非编码区和495 bp的完整开放阅读框，开放阅读框的起始位点在54 bp处，终止位点在548 bp处，编码164个氨基酸残基。

图1 石蒜LrRPL21基因的cDNA序列及核糖体蛋白L21的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence of LrRPL21 gene and am ino acid sequence of ribosomal protein L21 of Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.

2.2 石蒜核糖体蛋白L21的理化性质分析

使用ProtParam程序对LrRPL21基因编码的蛋白质一级结构和理化性质进行预测，结果显示该蛋白质的分子量为18628，理论等电点为10.36；分子式为C833H1348N254S4，半衰期为30 h，不稳定指数为40.63，脂肪指数为76.59，总平均疏水性指数为-0.668。因此，判定该基因编码的蛋白质为亲水性蛋白。

2.3 石蒜LrRPL21基因编码的氨基酸序列的同源性及系统树分析

将石蒜LrRPL21基因编码的RPL21氨基酸序列与其他8种植物RPL21的氨基酸序列进行同源性比较，结果见表1。由表1可以看出：石蒜LrRPL21基因编码的RPL21与其他8种植物RPL21的氨基酸残基数相同，均为164；它们的氨基酸序列有较高的同源性，同源性百分率达到85％～95％。其中，石蒜LrRPL21基因编码的 RPL21的氨基酸序列与油棕RPL21的同源性百分率最高，达到95％；与拟南芥RPL21的同源性百分率最低，但也达到85％。

表1 石蒜与其他8种植物核糖体蛋白L21氨基酸序列的同源性比较Table1 Homology comparison of am ino acid sequence of ribosomal protein L21 between Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.and other eight species

将石蒜LrRPL21基因编码的RPL21的氨基酸序列与油棕、毛竹、水稻、高粱、玉米、大麦、蒺藜苜蓿和拟南芥的RPL21氨基酸序列进行系统进化分析，获得的系统树见图2。结果显示：石蒜LrRPL21基因编码的RPL21与油棕RPL21的进化关系最近，与拟南芥RPL21的进化关系最远。该结果与同源性分析和经典分类的结果基本一致。

图2 基于核糖体蛋白L21氨基酸序列的石蒜与其他8种植物的系统树Fig.2 Phylogenetic tree of Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.and other eight species based on am ino acid sequence of ribosomal protein L21

3 讨论和结论

目前，分离克隆目的基因的方法有很多，在已经建立了高质量全长cDNA文库的基础上筛选目的基因，则以采用根据保守序列设计引物并进行PCR扩增的方法最为简单快速。本研究正是在建立了高质量石蒜叶片全长cDNA文库的基础上成功克隆获得了石蒜体内LrRPL21基因的全长cDNA序列。

核糖体蛋白L21是构成真核生物核糖体的80多种蛋白之一［1］。然而，许多核糖体蛋白除了组成核糖体和行使其功能以外，还具有其他重要的生理功能［5］。目前，对某些核糖体蛋白及其功能已有广泛研究，例如L11［12］，但有关植物核糖体蛋白L21及其功能的报道比较少。作者成功克隆获得了石蒜的LrRPL21基因，序列全长709 bp，编码1条具有164个氨基酸残基的多肽，预测分子量是18628，理论等电点为10.36，分子式为C833H1348N254S4，总平均疏水性指数为-0.668，属于亲水性蛋白。氨基酸序列比较结果表明：石蒜核糖体蛋白L21的氨基酸序列与其他8种植物核糖体蛋白L21的氨基酸序列的同源性百分率均较高，达到85％～95％，其中，石蒜核糖体蛋白L21与油棕L21氨基酸序列的进化关系最近。有关石蒜核糖体蛋白L21的功能有待进一步深入研究。

［1］Wool IG.The structure and function of eukaryotic ribosomes［J］.Annual Review of Biochemistry，1979，48：719-754.

［2］Mager WH.Control of ribosomal protein gene expression［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1988，949（1）：1-15.

［3］Espinosa L，Martín M，Nicolas A，et al.Primary sequence of the human，lysine-rich，ribosomal protein RPL38 and detection of an unusual RPL38 processed pseudogene in the promoter region of the type-1 angiotensinⅡ receptor gene［J］.Biochimica et Biophysica Acta，1997，1354（1）：58-64.

［4］Daigneault L，Beaulieu R，Filion M，et al.Cloning and identification of genes differentially expressed in metastatic and nonmetastatic rat rhabdomyosarcoma cell lines［J］.Clinical and Experimental Metastasis，1995，13（5）：345-356.

［5］Wool IG.Extraribosomal functions of ribosomal proteins［J］.Trends in Biochemical Sciences，1996，21（5）：164-165.

［6］Clemens MJ.Targets and mechanisms for the regulation of translation in malignant transformation［J］.Oncogene，2004，23（18）：3180-3188.

［7］Stoneley M，Willis A E.Aberrant regulation of translation initiation in tumorigenesis［J］.Current Molecular Medicine，2003，3（7）：597-603.

［8］阮龙喜.石蒜科植物生物碱的一些研究进展［J］.药学通报，1988，23（8）：453-455.

［9］袁菊红，权俊萍，胡绵好，等.石蒜SRAP-PCR扩增体系的建立与优化［J］.植物资源与环境学报，2007，16（4）：1-6.

［10］王春燕，夏 冰，李晓丹，等.石蒜叶片全长cDNA文库的构建［J］.江苏农业学报，2009，25（3）：542-546.

［11］江玉梅，汪 仁，束晓春，等.用改良CsCl密度梯度离心法提取石蒜叶片和鳞茎总RNA［J］.植物资源与环境学报，2008，17（3）：78-80.

［12］王玉瑶，张志云，梁爱华.核糖体蛋白L11及其功能［J］.生命的化学，2008，28（1）：104-106.