不结球白菜根尖体细胞染色体制片及其二倍体和四倍体有丝分裂过程观察

郑金双，张蜀宁，孙成振，王雅美

不结球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）又称小白菜，北方称油菜，为中国南方栽培面积最大、最大众化的蔬菜作物。目前在蔬菜作物生产应用中，多倍体仅见西瓜〔Citrullus lanatus（Thunb.） Mansf.〕［1］和不结球白菜［2］，其遗传性状稳定性、营养品质以及农艺性状均优于二倍体。对不结球白菜的生理代谢［3］、基因表达［4-5］等方面的研究已有报道，但细胞学方面的研究较为薄弱，主要原因在于其体细胞染色体小、制片难度大。目前仅见二倍体不结球白菜核型［6］及未减数2n配子的相关研究报道［7］，关于二倍体不结球白菜及其同源四倍体细胞有丝分裂的观察未见报道。

在十字花科（Cruciferae）植物的体细胞染色体制片过程中，常用的预处理剂是8-羟基喹啉［8］。目前用于植物体细胞染色体制片的预处理剂有多种，因而，也有研究者将不同的预处理剂用于十字花科植物体细胞染色体的研究，并获得了不同的预处理效果［9-11］。为了更有效地研究不结球白菜体细胞染色体形态，作者以二倍体不结球白菜根尖为实验材料，对其体细胞染色体制片条件进行了摸索；在此基础上，对二倍体及四倍体不结球白菜根尖体细胞的有丝分裂过程进行了观察，以期为不结球白菜及十字花科等小染色体植物的遗传进化、变异与基因定位研究提供必要的细胞学实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试的二倍体不结球白菜品种‘10P15’及同源四倍体不结球白菜品种‘10P11’种子由南京农业大学园艺学院白菜课题组提供。

1.2 方法

1.2.1 染色体制片条件筛选 种子于25℃恒温培养箱内催芽，待大部分根的长度约1.5 cm时于4℃冰箱中过夜，取出后置于25℃恒温培养箱内培养1～2 h，分别在根长小于0.5 cm、0.5～1.0 cm、1.0～2.0 cm及大于2.0 cm时取根尖，根尖长度1～2 mm，每个长度等级的根各取10条，重复取样3次，用20 mg·L-1放线菌酮溶液预处理2.0 h。

取长1.0～2.0 cm根的根尖，每处理50～80条，分别用2种方法进行预处理。方法一：将根尖置于蒸馏水中，于4℃冰箱中用冰水混合物分别冰冻处理21、22、23和24 h；方法二：将根尖置于7种预处理剂中分别预处理，以0.5 h为1个时间梯度。其中，在2 mmol·L-18-羟基喹啉溶液或2 mmol·L-18-羟基喹啉与质量浓度0.2 g·L-1秋水仙素等体积混合液中分别预处理1.5～3.5 h；在质量浓度0.2 g·L-1秋水仙素溶液中分别预处理1.5～3.0 h；在饱和对二氯苯溶液中分别预处理1.0～3.0 h；在质量浓度20或40 mg·L-1放线菌酮溶液或质量浓度40 mg·L-1放线菌酮与2mmol·L-18-羟基喹啉等体积混合液中分别预处理2.0～3.5 h。

经上述预处理的根尖用卡诺固定液〔V（无水乙醇）∶V（冰乙酸）=3∶1〕固定24 h，用0.075 mol·L-1KCl前低渗30min，然后用1 mol·L-1HCl于60℃解离约8 min，用蒸馏水后低渗10 min，卡宝染液染色约7 min，烤片及压片后，分别选10张具有代表性的制片，用Zeiss AX41显微镜于40倍镜下观察并在100倍镜下拍照；选10个视野统计细胞总数和中期分裂相数，并计算中期分裂相占细胞总数的百分率。

1.2.2 体细胞染色体有丝分裂过程观察 按上述条件催芽，待二倍体和四倍体不结球白菜根的长度为1.0～2.0 cm时分别取长度1～2 mm根尖，根据筛选出的制片条件，用质量浓度20 mg·L-1放线菌酮溶液预处理2.5～3.0 h，换卡诺固定液固定24 h后，用0.075 mol·L-1KCl前低渗30min，然后用1 mol·L-1HCl于60℃解离约8 min，蒸馏水后低渗10 min，卡宝染液染色约7min，烤片及压片后，用Zeiss AX41显微镜于40倍镜下观察并在100倍镜下拍照。

2 结果和分析

2.1 不结球白菜体细胞染色体制片条件分析

在不结球白菜根尖体细胞染色体制片过程中，分别选取长度小于0.5 cm、0.5～1.0 cm、1.0～2.0 cm和大于2.0 cm的根取根尖，获得的分裂相数目有明显差异。取样时根长度为1.0～2.0 cm，获得的分裂相数目相对较多，占细胞总数的64.75％，为根长小于0.5 cm和大于2.0 cm处理组的1.38和98.11倍。因而，根长度为1.0～2.0 cm对不结球白菜根尖体细胞染色体制片较为适宜。这一结果与张红梅等［12］的研究结果一致。

采用冰冻方法进行预处理，不同处理时间对分裂相的数量有明显影响。冰冻时间为22～23 h，获得的分裂相数量相对较多，占细胞总数的30.20％，分别是冰冻处理21和24 h的1.52和1.55倍。

图1 用不同预处理剂预处理后二倍体不结球白菜根尖中期染色体形态Fig.1 Chromosome morphology of metaphase in root-tip of diploid of non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）pretreated by different pretreatment agents

采用7种不同预处理剂对二倍体不结球白菜根尖细胞进行不同时间的预处理，对分裂相的数量及染色体形态有明显的影响，各处理组中期染色体形态见图1，中期分裂相百分率的统计结果见表1。用2 mmol·L-18-羟基喹啉预处理3.0～3.5 h，获得的中期分裂相适合染色体核型分析；预处理3.0 h，获得的的中期分裂相数目较多，占细胞总数的46.82％。用质量浓度0.2 g·L-1秋水仙素预处理2.5 h，获得的中期分裂相适合染色体核型分析；预处理1.5 h，获得的中期分裂相适合染色体分带研究；而预处理2.5 h，获得的中期分裂相数目较多，占细胞总数的57.32％。用饱和对二氯苯预处理1.5～2.0 h，获得的中期分裂相适合染色体核型分析；预处理1.0 h，获得的中期分裂相数目较多，占细胞总数的40.84％。用20 mg·L-1放线菌酮溶液预处理2.5～3.0 h，获得的中期分裂相适宜于染色体核型分析；预处理2.0 h，获得的中期分裂相则适宜于染色体分带研究；而预处理3.5 h，获得的中期分裂相数目较多，占细胞总数的53.65％。用40 mg·L-1放线菌酮溶液进行预处理，易导致染色体加倍，不利于分析。用40 mg·L-1放线菌酮与2 mmol·L-18-羟基喹啉等体积混合液预处理3 h，获得的中期分裂相适宜于染色体核型分析；预处理1.5～2.5 h，获得的中期分裂相适宜于染色体分带研究；而预处理2.0 h，获得的中期分裂相数目较多，占细胞总数的65.40％。用2 mmol·L-18-羟基喹啉与0.2 g·L-1秋水仙素等体积混合溶液预处理2.5 h，获得的中期分裂相适宜于染色体核型分析；预处理1.5～2.0 h，获得的中期分裂相适宜于染色体分带研究；而预处理2.5 h，获得的中期分裂相数目较多，占细胞总数的43.18％。

表1 用不同预处理剂预处理后二倍体不结球白菜根尖中期分裂相的百分率Table1 Percentage of sp lit phase of metaphase in root-tip of dip loid of non-heading Chinese cabbage（Brassica campestris ssp.chinensis Makino）pretreated by different pretreatment agents

2.2 二倍体和四倍体不结球白菜体细胞有丝分裂过程观察

二倍体和四倍体不结球白菜根尖体细胞有丝分裂过程的观察结果见图2。由图2可见：二倍体和四倍体不结球白菜体细胞有丝分裂行为相似。在间期（图2-1，13），染色质没有高度螺旋化形成染色体，而是以染色质的形式进行DNA单链复制；在前期，染色体螺旋化缩短变粗（图2-2～4，14～16）；在中期，染色体着丝点排列在赤道板上，纺锤丝附着在着丝点上，染色体浓缩变粗（图2-5，6，17，18），显示出不结球白菜特有的染色体数目和形态；在后期，着丝点一分为二，每条染色体的2条姊妹染色单体分开并移向两极，同一细胞内的各条染色体都以基本相同的速率同步移向两极（图2-7～9，19～21）；在末期，染色体到达细胞两极（图2-10，11，22），1个母细胞分裂成2个子细胞（图2-12，23），染色体解螺旋，进入下一次有丝分裂。

由图2还可见：四倍体不结球白菜体细胞在分裂过程中还会出现一些异常现象。体细胞染色体配对成二价体及多价体（图2-24中箭头所示），同一细胞中2条或3条染色体部分配对成二价体或三价体；有些细胞有丝分裂后期出现染色体桥（图2-25），并产生落后染色体（图2-26）；正常的有丝分裂过程中，后期染色体会分向两极，而当染色体异常分裂时，后期染色体会被不均等的拉向二极、三极甚至四极（图2-27～29）；四倍体染色体数目为2n=40，但个别细胞中会出现着丝粒未分裂的现象，即内源有丝分裂（图2-30）。

3 讨论和结论

对植物体细胞的染色体计数、核型分析、外源染色体鉴定（染色体分带和染色体原位杂交等）、染色体的分组和分离，都需要有一定数量处于有丝分裂中期的细胞才易于进行［13］。理论上，任何时间取样都可以从正常生长的根尖分生组织部位获得中期分裂相［14］。但如果分裂相很少，就会阻碍进一步的核型分析、分带研究以及原位杂交等相关研究。李懋学等［15］认为：对小染色体植物进行适当的变温处理可增加分裂相，预处理是染色体制备的关键步骤之一。本研究结果表明：选取长度1.0～2.0 cm根的根尖，分裂相数目较多。采用冰冻预处理22～23 h，也能获得一定量的分裂相，但均少于采用不同预处理剂获得的分裂相数量。用2 mmol·L-18-羟基喹啉进行预处理，染色体长度较短，只适用于核型分析及计数；用质量浓度0.2 g·L-1秋水仙素、质量浓度40 mg·L-1放线菌酮与2 mmol·L-18-羟基喹啉等体积混合溶液以及2 mmol·L-18-羟基喹啉与0.2 g·L-1秋水仙素等体积混合溶液进行预处理，染色体相对较长，仅适用于染色体计数和核型分析；用饱和对二氯苯或质量浓度20 mg·L-1放线菌酮进行预处理，染色体较长，着丝点及随体也最清晰，其中用质量浓度20 mg·L-1放线菌酮进行预处理，获得的分裂相数目较多。根据比较结果，在进行不结球白菜体细胞染色体有丝分裂观察研究时，取样时根长以1.0～2.0 cm为宜，最适宜的预处理方法是用质量浓度20 mg·L-1放线菌酮浸泡2.0～3.0 h。

同源四倍体不结球白菜有丝分裂行为与二倍体相似，但在四倍体的体细胞有丝分裂过程中存在异常现象，如细胞分裂异常、内源有丝分裂等；此外还偶见染色体数目异常，2n=24～67，多集中于2n=36～44，占细胞总数的12％，小于2n=36的占3％，大于2n=44的占0.4％，这种异常现象可能是体细胞分裂异常及内源有丝分裂造成的。张红梅等［16］认为：四倍体有丝分裂异常可能是由于染色体加倍打破了二倍体中各种固有的平衡，造成内源激素不协调和生理生化过程不正常等。一般认为，端粒融合和染色体结构异染色质是促使体细胞染色体配对的主要原因［17］。Stebbins［18］认为：同源四倍体染色体加倍造成特定基因位点纯合，隐性基因控制性状，以及不正常分离。而四倍体不结球白菜体细胞有丝分裂产生异常现象的具体原因尚有待进一步研究。

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