浅析聚合酶链反应技术检测食品中沙门氏菌

吴丽苹

（汕头市质量计量监督检测所，广东 汕头 515000）

一、PCR的原理及技术发展

聚合酶链反应技术是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片断的方法。该技术于1985年由美国的KaryMullis等人首创并由美国,Cetus公司开发。其原理是：在存在DNA模板、引物、DNTP、适当缓冲液(Mg2+)的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片断进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火(复性)、延伸等三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。由于每一周期产生的DNA片断均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数形式增加。

目前，聚合酶链反应技术本身获得长足进步，可靠性不断提高，以聚合酶链反应技术为基础的相关技术得到了很大的发展。如反相PCR(lnverse-PCR)、反转 PCR(RT-PCR)、随机扩增多态性 DNA技术 (RAPD)，免疫 PCR(lmmuno-PCR)，不对称 PCR(Asymmetric PCR)、多重PCR(MultipleprimerPCR)、固相PCR等。在关键技术上也有所进步，如热循环仪在质量和技术上的发展；引物的设计可通过计算机和网络来实现；已发展出多种具有各种不同特性的聚合酶体系和酶反应体系；目前已开发出了一系列的DNA聚合酶试剂盒，简化了聚合酶链反应技术操作，提高了实验的重现性。

二、聚合酶链反应技术检测食品中沙门氏菌

1.模板的制备。聚合酶链反应技术检测方法的可靠性一部分依赖于目标模板的纯度和足够的目标分子数量，大多数聚合酶链反应检测仍要求富集步骤。研究表明，如果细菌在检测前可从食品原样中分离、浓缩、纯化，许多快速分子学方法的检测效果可得以改善。目前，离心、过滤、阴阳离子交换树脂、固定化凝集素和免疫磁性分离法已报道用于食品体系中细菌的浓缩。LisaA Lucore等研究了金属氢氧化物固定技术对乳品中肠炎沙门氏菌细胞的浓缩。用锆氢氧化物与细胞固定后，样品体积减少50倍，接种的细菌有78%～96%复苏，固定化的细菌仍保持活力可用标准培养法计数。用聚合酶链反应技术检测，限值为101～102cfu/25mLNFDM(复原无脂干奶粉)。对全脂牛奶、冰淇淋检测，限值分别为≥102cfu/mL和≥101cfu/mL。该法可很好解决减少样品体积，有活性细菌的浓缩，聚合酶链反应抑制剂的去除等问题。KeithALampel则应用FTA过滤来制备模板。FTA过滤器是一种渗透有螯合剂和变性剂的纤维状基质，这些物质可有效地在与微生物接触中与之螯合使之解离。作者用来源于纯培养基和人为污染食物中不经前增菌和纯化的鼠伤寒沙门氏菌进行FTA过滤，滤液直接作为模板来分析该法的敏感性和可运用性。结果表明，FTA过滤来制备聚合酶链反应模板可减少步骤、时间，可显著减少样品的丢失，防止敏感性下降。。

2.引物设计。根据所选沙门氏菌靶序列的不同，目前常在下面几种序列内进行引物设计。

（1）沙门氏菌鞭毛蛋白的基因序列在许多细菌中，鞭毛都是重要的毒力因子，不仅鞭毛所提供的动力可能是细菌侵入细胞的重要因素，鞭毛可以作为粘附素，决定了细菌在细胞表面的吸附，以及其后的侵入和定居过程。Song等根据该序列设计内、外引物进行套式聚合酶链反应，除伤寒沙门氏菌能扩增出特异性DNA片断外，其余沙门氏菌和其它菌群均无特异性扩增，且能与副伤寒沙门氏菌区别开。

（2）编码菌毛的fimA基因序列已证明，细菌表面的附属器官如菌毛，纤毛介导与上皮表面的特异受体相结合。鼠伤寒沙门氏菌和其它肠道菌科的其它病原菌产生形态、抗原相关的侵袭性I型菌毛。在沙门氏菌株中，I型菌毛表型的表达由一系列基因编码，fimA基因编码主要的菌毛亚单元。Cohen等根据fimA基因设计特异引物，用于牛奶等食品样品中沙门氏菌的PCR检测。

（3）与沙门氏菌质粒毒力相关的,SPV基因序列对许多有重要医学意义的细菌来说，质粒不仅编码毒力因子，还编码某种调控蛋白，控制毒力因子的产生。含有致病性质粒的细菌是致病性的，丢失了致病性质粒的细菌，对人或动物不再致病，或致病力下降。Mahon等以鼠伤寒沙门氏菌的质粒毒力相关基因,SpvR合成引物进行聚合酶链反应检测，结果含该基因的沙门氏菌株都得到了特异性的扩增产物，而不含质粒和含质粒而无该毒力基因的菌株无特异性扩增。

（4）编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的inv基因序列沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌等许多肠道病原性细菌具有侵袭宿主上皮细胞的能力。侵袭是病原菌导致慢性感染的原因之一。inv基因序列是一组基因，包括invA、invB、invC、invD、invE等。Rahn等人根据invA基因设计引物，进行PCR检测，结果沙门氏菌属都得到特异性的DNA片断，而非沙门氏菌无特异性扩增。

（5）沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白hilA在沙门氏菌中已发现了5个毒力岛，分别命名为,SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5。其中,SPI1编码 III型分泌系统，与沙门氏菌对肠道上皮细胞的侵袭力有关。SPI1存在于所有侵袭性沙门氏菌中。hilA为,SPI1的毒力基因之一，是许多侵袭基因的正转录调节蛋白。XuanGuo]用根据hilA和sirA设计的四对引物以检测番茄原料中,SalmonelleMontevido,其中有一对hilA引物可特异性检测沙门氏菌。

（6）编码沙门氏菌LPSO抗原的rfb基因脂多糖(LPS)作为革兰氏阴性菌外膜主要成分，其多糖部分(含O-特异性多糖和核心多糖)参与了细菌对宿主细胞的粘附、侵袭和在细胞间扩散的过程，是细菌主要的致病因子之一。Luk等根据rfbJ、rfbS,基因序列分别设计引物，可检测A、B、C、D组血清型沙门氏菌。

（7）编码与蛋白质结合的DNA的hns基因Jones.D.D根据该序列设计了上游引物LHNS-531和下游引物RHNS-682及一条25个核苷酸的探针HNS-P，对牡蛎中污染的沙门氏菌进行PCR-基因探针检测，该方法可以＜40个细胞的敏感性检测沙门氏菌属中的多个种。

（8）检测方法。近年来，用聚合酶链反应技术检测沙门氏菌得到了迅速发展，产生了许多种聚合酶链反应技术。如常规A-B、套式聚合酶链反应、多重聚合酶链反应。也可几种方法结合使用，如李君文[等将常规聚合酶链反应与半套式聚合酶链反应相结合，根据沙门氏菌中保守的6SrRNA基因为模板设计了一对引物，扩增的片段为555bp。经过优化设计反应条件，只对沙门氏菌产生特异扩增，敏感性达30cfu。为了对扩增结果进行鉴定，又在这两条引物之间设计一条半套式引物。经半套式聚合酶链反应检测证明第一次产物是正确的，且灵敏度提高至3cfu。此外，还可将聚合酶链反应与微孔板检测、与WLISA技术、与探针杂交有机结合起来。

在试图减少检测时间方面，RFerretti采用在缓冲蛋白胨水(BPW)中非选择性增菌6h，然后进细胞破碎和聚合酶链反应，可在接受食品样品后12h内完成检测，并可检测不同沙门氏菌血清型。试验表明，在BPW8h增菌后，方法的灵敏性不增加，这限定了最佳增菌时间。增菌后，粗提、聚合酶链反应、电泳共需5～6h，这样可在12h内完成，相对其他需更长增菌时间的检测方法来说缩短了时间。

结束语。聚合酶链反应技术检测沙门氏菌的特异性，取决于所选择的扩增靶序列是否为沙门氏菌高度保守的特异性片断，能否忠实地扩增靶序列，由人工合成的一对寡核苷酸引物序列决定。显然靶序列的选择和引物的设计是试验成功与否的关键。由于其快速、特异、敏感的特点，PCR技术作为一种检测手段仍有巨大的运用价值。而且随着研究的不断深入，聚合酶链反应技术检测方法也会得以发展和完善，并将在食品沙门氏菌及其它致病菌的检测中得到更多的应用。

[1]韩光明，张建琼.聚合酶链反应技术检测沙门菌的研究进展 [J].国外医学：微生物学分册，2000，6.

[2]李景鹏，李成梅.应用聚合酶链反应技术检测沙门氏菌[J].中国兽医学报，1998，6.