简单重复序列（AAG）5在百萨偃麦草染色体上的分布

温辉芹，裴自友，任永康

（山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030032）

百萨偃麦草（Thinopyrum bessarabicum，2n=2x=14，JJ）为自花授粉的多年生海岸禾草，原产于黑海和地中海沿岸，是偃麦草属中基因组最简单的二倍体物种。J 染色体是偃麦草属的基本染色体组，在小麦亲缘物种中，J 染色体组仅次于S，广泛分布于多倍体物种中。百萨偃麦草对环境胁迫和生物胁迫具有很强的抗性，是小麦遗传改良的重要资源[1]。

分子原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）是在分子水平上检测外源染色质的一种有效方法，根据所用探针不同分为物种专化重复序列原位杂交、基因组原位杂交和单拷贝或寡拷贝序列原位杂交等。高等植物的基因组内含有大量的重复DNA 序列，根据其拷贝数将重复序列划分为卫星DNA（高度串联重复序列）、小卫星和微卫星DNA（中度串联重复序列）、转座子（中度弥散、具转座功能）[2]。利用重复序列ISH 分子核型的建立对染色体的识别非常有效。Mukai 等[3]根据pSc119.2和pAs1 这2 个重复序列的双色原位杂交，建立了普通小麦的分子核型，可以识别全部21 条染色体中的17 条。简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR） 又称微卫星DNA（microsatellites DNA），它是一类由1～6 个碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。研究表明，一个基因的不同位点的SSR 在调节基因的表达和决定产物上起着重要作用。SSR 标记技术已被广泛用于遗传图谱的构建、品种指纹图谱的绘制以及目标性状基因标记筛选、起源进化等领域[4]。Pedersen等[5-6]发现，来自大麦的pHvG38 克隆（GAA-卫星序列）可以在大麦、小麦、黑麦以及其他小麦族物种染色体上产生与N-带完全一致的核型图谱，利用pHvG38 和克隆pAs1 的双色原位杂交建立了可以区分普通小麦全部21 条染色体的分子核型。目前，利用标记的简单重复序列进行的原位杂交开展了对甜菜、鹰嘴豆、六倍体普通小麦、大麦、黑麦、小黑麦、果蝇和人类染色体上微卫星物理位点的研究[5，7-13]。

本研究以简单重复序列（AAG）5为探针，进行荧光原位杂交，检测其在百萨偃麦草上的位置，建立百萨偃麦草的（AAG）5荧光核型。

1 材料和方法

1.1 材料

百萨偃麦草由山西省农业科学院作物科学研究所保存。简单重复序列（AAG）5由日本葛莱娜有限公司合成、日本鸟取大学农学部植物遗传育种实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 根尖细胞染色体制片 百萨偃麦草种子发芽前先浸种处理24 h，然后将种子放在垫有湿滤纸的培养皿内于4 ℃冰箱中处理1 周左右，再放到23 ℃培养箱中发芽，待根长约1～2 cm 时剪取根尖，在冰水中预处理22～24 h 后，用酒精-冰醋酸（3∶1）固定液固定。用45%醋酸洋红制片，-70 ℃冰箱冰冻揭片。

1.2.2 探针标记 采用3′末端标记方法（3′End labeling method），用tetramethyl-rhodamine-5-dUTP 标记合成的简单重复序列（AAG）5。反应液配制：将1.5 mL 离心管置于冰上，依次加入5×TdT Reaction buffer 4 μL，终浓度为100 pmol/L的（AAG）5，CoCl2（25 mmol/L）4 μL，tetramethyl-rhodamine-5-dUTP（25 nmol/μL，Roche）1 μL，Terminal Transferase rec 1 μL，最后加ddH2O 至总体积为20 μL，混合、离心后，37 ℃温育15 min，再将离心管置于冰上，加入Stop buffer（0.2 mol/L EDTA，pH 值为8.0）2 L，混匀，放入-20 ℃冰箱备用。

1.2.3 荧光原位杂交（FISH）及信号检测 荧光原位杂交主要参照Kishii 等[14]的程序，具体如下。

（1）制片变性：根尖制片放置于0.2 mol/L NaOH/70%Ethanol，室温条件下5 min，变性后的制片在-20 ℃的70%，90%，100%乙醇溶液中各5 min 梯度脱水，杂交前气干备用。

（2）杂交液配制及变性：每10 μL 杂交液含去离子甲酰胺（Formamide）5 μL，50% Dextran sulfate 2 μL，20×SSC 1μL，探针（AAG）50.5 μL，ddH2O 1.5 μL。轻轻混匀，100 ℃下变性5 min，然后立即放置于碎冰中冷却5 min 以上。

（3）杂交：每张制片加10 μL 探针混合液，用18 mm×18 mm 的盖玻片盖好（胶水封住四周），放置于有湿润滤纸的塑料盒内，37 ℃杂交过夜。

（4）洗片：取出充分杂交的制片，用镊子小心去掉胶水和盖玻片，在0.1%TritonX-100/2×SSC室温下洗脱5 min，2×SSC 室温浸洗5 min，用洗耳球吹干。

（5）染色及镜检：制片加10 μL 用VECTA shield（Vector）胶配置的DAPI 套染和封片，盖上盖片（20 mm×20 mm），用Olympus BX61 荧光显微镜观察、照相。各染色体根据臂比和荧光带型用Adobe PhotoShop 6.0 软件编辑排列。

2 结果与分析

以简单重复序列（AAG）5为探针，对百萨偃麦草的荧光原位杂交结果如图1 所示。图1 结果表明，（AAG）5在百萨偃麦草的绝大部分染色体上具有明显的荧光带纹，可以很好地将7 对百萨偃麦草染色体区分开来。荧光信号在不同的百萨偃麦草染色体上的强弱不同，而且在不同位点也有变化，信号的强弱反映了拷贝数的多少。

由于百萨偃麦草每条染色体所属的部分同源群尚不清楚，用J1～J7表示百萨偃麦草7 对染色体，建立了百萨偃麦草7 对染色体的（AAG）5荧光原位杂交核型排列图（图2）。各染色体（AAG）5荧光带型特征为：染色体J1，染色体最长，有很弱的着丝粒带和长臂中间带；染色体J2，染色体短臂无带、具长臂中间带；染色体J3，无明显带纹；染色体J4，有较强的着丝粒带，长臂具近着丝粒带；染色体J5，长、短臂均有强的近着丝粒带；染色体J6，具有着丝粒带、长臂近着丝粒带和中间带；染色体J7，具有着丝粒带。

3 讨论

简单重复序列分布于编码区和非编码区，通常与异染色质相关联。许多重复序列在小麦近缘种甚至不同属间是共享的，但在不同基因组中分布模式是不同的[2]。简单重复序列的FISH 结果表明，SSR 在染色体上有成簇分布的，也有弥散分布的[15]。目前，利用的有单碱基、2 个碱基、3 个碱基和4 个碱基重复的长度在15～20 bp 的简单重复序列，并建立了在有丝分裂、减数分裂染色体和线性染色体上鉴定目的简单重复序列富集区的非变性荧光原位杂交方法[16]，这将有益于基因组分析和简单重复序列在染色体上的结构功能的研究。合成的寡核苷酸探针（简单重复序列）由于链短，其序列复杂度低，相对分子质量小，杂交效率明显高于长探针；寡核苷酸探针可识别靶序列内1 个碱基的变化，具有可大量人工合成、价格低廉等独特的优点。通过高度重复序列与简单重复序列作探针的多色FISH 和多重FISH 技术已被广泛应用于构建染色体物理图谱，进行基因组分析、核型关系、遗传多样性和进化的研究，还可发现进化过程中的染色体重排。

已有45SrDNA 在百萨偃麦草染色体上的分布研究[17-18]，今后应进一步结合其他的重复序列，如pAs1，pSc119，pTa794（5SrDNA）和简单重复序列的荧光原位杂交相结合对同一个有丝分裂中期细胞的染色体进行连续、多色FISH，建立每条染色体的综合荧光核型。本研究表明，（AAG）5在供试的百萨偃麦草的各染色体间存在很大的差别，百萨偃麦草（AAG）5位点的鉴定，为在分子水平上研究小麦族的物种起源与进化提供了新的信息。本研究中发现用荧光素（Fluorescein-12-dUTP）标记（AAG）5的效果（荧光信号强度）要差些，因此，在采用荧光素标记作探针时，杂交液中要适当加大探针的用量，以获得理想的效果。这与王苏玲和庄丽芳等[19-20]的研究结果一致。本研究未发现百萨偃麦草有明显的随体染色体，而Endo 等[21]的结果却显示百萨偃麦草具有2 对随体染色体。具体各同源群的百萨偃麦草染色体荧光带型的确定还需要利用全套的中国春-百萨偃麦草二体异附加系作进一步研究，但研究发现导入小麦背景的百萨偃麦草染色体存在染色体重排现象[22]，因为染色体结构的微小变化往往表现为带型的多态性。说明在百萨偃麦草的进化过程中经历了较多的变化，为今后的鉴定带来了一定的难度。

不同物种的染色体C-分带带型有明显的差异，因而可用作鉴别物种的依据[19]。染色体分带作为常用的细胞学鉴定手段，其效果受染色体制片质量和吉姆萨（Giemsa）染液的影响较大。利用重复序列的染色体识别技术是分带技术的有益补充。分带大多只能在组成性异染色质区产生带纹，对于异染色质少的染色体的鉴定往往成效不大。利用不同的重复序列探针可以产生不同的分子核型，基因组原位杂交（GISH）、多个重复序列探针相结合的双色或多色FISH 技术以及分子标记等多种技术相结合可以更高效地识别染色体的身份。

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