抗丝黑穗病玉米种质资源的SSR标记遗传多样性分析

王艳梅 ，田 歌 ，王陆军 ，王 燕 ，李 欣 ，赵 明

（1.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030032；2.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；3.山西省农业科学院玉米研究所，山西忻州034000；4.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031）

近年来，随着科学技术的不断发展，分子标记技术已成为玉米遗传育种的有力工具。该技术为玉米育种、优势类群划分及杂种优势模式的建立提供了分子水平上的理论依据，并且加快了选择育种进程，同时为抗性基因的定位、克隆、转化打下了坚实的基础。由于SSR标记具有引物丰富、多态性高等特点，利用其进行抗病玉米种质的遗传多样性评价更具优势。中国农业科学院袁力行等[1]利用4种分子标记方法（RFLP，RAPD，AFLP和SSR）研究了玉米自交系的遗传多样性，认为RFLP，SSR更适合玉米遗传多样性的研究。

本研究利用SSR标记技术，以40份丝黑穗病抗性不同的国内常用和自选玉米自交系作为试验材料，分析其遗传多样性，旨在为抗玉米丝黑穗病种质资源的改良及运用、抗病自交系和杂交种的选育等育种实践提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

选用40份对玉米丝黑穗病具有不同抗性的常用和自选玉米自交系作供试材料，其系谱及抗性列于表1。材料分为2个部分：（1）6份标准测验种，包括黄早四，丹 340，Mo17，B73，掖 478 和齐319，依次代表唐四平头，旅大红骨，Lancaster，Reid，PA和 PB这6个类群；（2）34份常用和自选自交系。供试材料均经过多年自交，遗传稳定。

表1 40份供试玉米自交系对丝黑穗病的抗性及系谱来源

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取与纯化 玉米种子在20～30℃暗箱培养4～5 d后，每自交系混合取10株黄化苗叶片，按CTAB法抽提、纯化DNA[2-3]。

1.2.2 SSR引物筛选 由上海生物工程公司合成110对SSR引物，以供试玉米材料基因组DNA为模板，筛选出扩增条带清晰[4]、多态性高的引物57对。

1.2.3 SSR扩增 采用20μLPCR反应体系：包括 10×buffer（含 Mg2+）2.0μL，2.5 mmol/L dNTPs1.0μL，1 U Taq DNA聚合酶，10μmol/L SSR引物1.0μL，50 ng模板DNA，灭菌无离子水。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃1min，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，扩增 35 个循环；72℃延伸10min，最后在4℃保存。扩增在PTC-100上完成。

1.2.4 扩增产物检测 扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，银染检测[5]，扫描记录。

1.2.5 数据统计 依据SSR扩增检测结果，在相同迁移位置有带记为1，无带记为0，缺失记为9，建立数据库。遗传相似系数（Genetic Similarity，GS）按照公式GS=m/（m＋n）计算，其中，m为基因型间共有带数目，n为基因型间差异带数目。按照UPGMA方法对供试自交系进行聚类分析。多态性信息量（PIC）按公式PIC=1－∑Pi2计算，其中，Pi表示第i个位点等位变异出现的频率[6]。所有数据统计均由NTSYS 2.10e软件完成。

2 结果与分析

2.1 SSR标记数据分析

本研究从110对SSR引物中筛选出扩增带型清晰稳定的57对引物，对40份玉米丝黑穗抗性不同的自交系进行扩增，总计10 880个扩增带，其中，76个为双带，3个无带，其余99.3%以上均为单带。57对SSR引物平均分布于玉米的10条染色体上（表2），在供试材料中共检测到272个等位基因位点，平均每对引物检测到4.77个。PIC变化在0.296～0.791之间（表2），平均为0.613，其中4号引物PIC最大，为0.791，46号引物的PIC最小，为0.296。

表2 57对SSR引物扩增片段在染色体的位置及对40份自交系扩增的多态性信息量

2.2 40份自交系类群划分

根据SSR数据得出，40份玉米自交系的遗传相似系数（GS）在0.610～0.993之间。利用NTSYS 2.10e软件，用UPGMA方法建立聚类图（图1）。在GS为0.72时，40份自交系分为5大类群[7]（表3）。A群是以黄早四为代表的唐四平头群，共4份；B群是以丹340为代表的旅大红骨群，共6份；C群是以Mo17为代表的Lancaster群，共6份；D群是BSSS群，分为2个亚群，以B73为代表的Reid亚群，共2份，以掖478为代表的PA亚群，共6份；E群是以齐319为代表的PB群，共16份。结合分析供试自交系的系谱资料（表1），利用SSR标记划分的类群与其种质类群具有较好的一致性。

2.3 抗丝黑穗病种质类群分析

从SSR聚类结果得出，33个抗病或中抗丝黑穗病的玉米自交系被划分在5大类群中（表4）。其中，唐四平头群2份中抗，2份高感；旅大红骨群和Lancaster群均为中抗或抗；BSSS群中抗以上的种质4份，感病的种质4份；PB群中有15份中抗以上的品种，只有1份高感种质。

表3 40份玉米自交系的SSR标记聚类结果

表4 40份玉米自交系丝黑穗病抗性的类群分布

3 讨论

本研究采用SSR标记，并在供试自交系中加入6大玉米种群标准测验种，成功将40份玉米自交系聚类划分为5大种群，其中D群含有2个亚群，划分结果与传统玉米自交系遗传系谱的划分结果[8]一致性很高，并且成功区分了BSSS的2个亚群Reid群与PA群（Ried改良）。E28与以丹340为代表的旅大红骨群的遗传距离较远的关系也得到了正确体现；改65、郑58-2、铁7922等均划入了正确的类群；未知材料Ty93-2被划入了旅大红骨群。实际上玉米育种中优良的杂交组合均产生在SSR标记聚类划分的类群间，无一产生在类群内。例如，优良组合中单2号（Mo17×自 330）、铁丹 9号（铁 7922×丹 340）等组合的父母本均产生在不同的类群间，这从实践上证明了SSR标记技术是划分玉米自交系种群的有效工具。

供试材料中33个抗病或中抗丝黑穗病的玉米自交系分布在6个不同类群中，根据杂种优势利用的原理，均可用于改良类群内的感病自交系和选育抗病自交系。尤其是旅大红骨群、Lancaster群和PB群中抗病自交系较多，可以构建抗病种质群体。目前，国内外开展的玉米丝黑穗病抗源鉴定表明：抗丝黑穗病的玉米种质资源并不丰富，尚未发现绝对免疫材料。希望本研究结果能为玉米抗丝黑穗病的遗传机制阐明、抗玉米丝黑穗病新种质和新品种的创新、增强我国玉米抗病种质创新能力提供技术储备。

［1］ 袁力行，傅骏弊，Warburton M，等.利用 RFLP，SSR，AFLP 和RAPD标记分析玉米自交系遗传多样性的比较研究[J].遗传学报，2000，27（8）：622-627.

［2］ Saghai-Maroof M A，Soliman K M，Jorgensen R A，et al.Ribosmal DNA spacer length polymorphisms in barley:Mendelian inheritance,chromosomal location and population dynamics[J].Proceeing of the National Academy of Science USA，1984，81：8018-8041.

［3］ 李艺，铁双贵，朱卫红，等.快速CTAB法提取玉米种子胚基因组 DNA[J].河南农业科学，2008（2）：17-20.

［4］ 王陆军，白建荣，王艳梅，等.山西省主推玉米杂交种纯度鉴定 SSR核心引物的筛选 [J].山西农业科学，2010，38（1）：19-22.

［5］ 李新海，焦少杰，傅骏骅，等.两种凝胶电泳系统对SSR标记多态性的影响[J].安徽农业科学，2001，16（2）：43-48.

［6］ Smith JSC，Chin ECL，Shu H，etal.An evaluation of theutility of SSR lociasmolecularmarkers inmaize（Zeamays L.）:Comparisonswith data from RFLPsand pedigree[J].Theoretical Applied Cenetic，1997，95：163-173.

［7］ 袁力行，傅骏弊，张世煌，等.利用RFLP和SSR划分玉米自交系杂种优势群的研究[J].作物学报，2001，27（2）：149-156.

［8］ 高洁，祁新，蔚荣海，等.对丝黑穗病不同抗性的玉米自交系的遗传多样性研究 [J].吉林农业大学学报，2006，28（8）：490-493.