TGF－β1在雷奈酸锶促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中的作用*

王小娜， 李 正， 王 瑒， 兰爱平， 吴 文

(1 南方医科大学，广东 广州510515;2广东省医学科学院，广东省人民医院东病区内分泌科，广东 广州510080;3中山大学中山医学院生理学教研室，广东 广州510080)

雷奈酸锶(strontium ranelate，Sr)是一种新型的抗骨质疏松药物，具有抑制破骨细胞骨吸收和促进成骨细胞骨形成的双重作用［1］。临床试验表明，它能够降低绝经后妇女发生椎体骨折和非椎体骨折的风险，同时能预防骨量减低［2－3］。已有研究表明锶可通过细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal－regulated kinase 1/2，ERK1/2)和p38 丝裂原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)信号通路调节成骨细胞特异性转录因子Runx2 的转录活性，Runx2 则调节下游成骨蛋白，如骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)Ⅱ型胶原(collagen type Ⅱ，Col Ⅱ)的表达，促进MSCs 的成骨分化［4－5］。而近年发现转化生长因子(transforming growth factor β1，TGF－β1)在大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)成骨分化过程中也起着重要作用，具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成和调节机体免疫作用［6］。体外实验表明，TGF－β1可促进骨膜间充质干细胞的增殖分化，促进成骨(软骨)细胞的增殖，刺激Runx2、I 型胶原、骨连结素(ostocnectin)和OPN 的合成。同时，可抑制破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收作用，并降低成脂标志物的表达［7］。由此可见，TGF－β1在骨组织代谢过程中起着十分重要的作用。然而，Sr能否通过TGF－β1促进rBMSCs 向成骨细胞分化尚未见报道。为此，本文旨在重点探讨:(1)Sr 对rBMSCs TGF－β1表达的影响;(2)TGF－β1是否在Sr 促进rBMSCs 向成骨细胞分化中起作用，以便为Sr 的促成骨作用机制提供实验资料。

材 料 和 方 法

1 主要材料

Sr 干混悬剂由Servier 公司提供;4 周龄雄性SD大鼠购自中山大学实验动物中心;DMEM/F12 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibico;青霉素、链霉素购自华北制药;细胞裂解液、地塞米松、维生素C、β－甘油磷酸钠、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)购自Sigma;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;细胞茜素红钙染色试剂盒购自上海杰美基因医药有限公司;兔抗大鼠TGF－β1单克隆抗体和SB431542 购自Bioworld。

2 主要方法

2.1 rBMSCs 的分离培养及传代 取4 周龄，雌雄不限SD 大鼠颈推脱臼处死，75%乙醇浸泡10 min，无菌条件下剪除双侧股骨和胫骨，剔除其表面肌肉及软组织，用10 mL 注射器吸取含有10%胎牛血清、1 ×105U/L 青霉素G、100 mg/L 链霉素的DMEM/F12 培养液冲洗骨髓腔，直至骨髓腔发白。移至15 mL离心管，1 000 r/min 离心10 min，制成单细胞悬液，以(1 ～3)×105cells/cm2接种于25 cm2的培养瓶中。在37℃、5% CO2培养箱内进行培养。24 h后半量换液，以后每2 ～3 d 换1 次液，至细胞融合至80%时，用成骨诱导液(含10－8地塞米松、0.2 mmol/L维生素C 和10 mmol/L β－甘油磷酸钠)培养rBMSCs［8］。本实验原代rBMSCs 培养1 ～2 d 即可见到细胞贴壁，4 ～5 d 观察到成纤维细胞集落形成，悬浮的淋巴细胞等造血系细胞经过换液操作后大部分被去除，9 ～11 d 细胞集落间相互融合成单层，形态多为梭形成纤维细胞。

2.2 ALP 的测定 取培养第3 ～5 代的细胞，以1 ×108/L 的密度接种于96 孔板，每孔200 μL，每孔设4个复孔。检测时将细胞洗涤后以0.2 % Triton X－100 裂解液及反复冻融法充分裂解，裂解液经低温离心机12 000 ×g 离心10 min，取上清50 μL ，按试剂盒说明书进行操作，于酶标仪520 nm 波长处测定ALP 值。

2.3 细胞茜素红钙结节染色 取培养第3 ～5 代细胞，调整细胞浓度为1 × 108/L ，接种于6 孔板，6 孔板底部预先置入消毒过的载玻片，给予相应的处理因素后第21 d 按照细胞茜素红钙结节染色试剂盒说明书对样本进行固定、染色及澄清处理，倒置显微镜下观察钙结节染色情况，每组取4 个样本，每样本随机取1 个视野(×100)，比较各组间的差异。

2.4 Western blotting 检测TGF－β1表达及半定量分析 收集的细胞用冰冷的PBS 洗涤细胞2 次，加适量细胞裂解液，在冰上将细胞迅速刮下，将裂解产物移至EP 管，10 000 r/min 离心10 min，吸出上清液体，用BCA 方法进行蛋白质浓度测定。将提取的蛋白质样品加入等体积上样缓冲液，100 ℃煮5 min，在15%聚丙烯酰氨凝胶电泳，电泳后将胶上所需蛋白条带转印至PVDF 膜。PVDF 膜用5%脱脂奶粉室温下封闭90 min，加入1∶1 000 稀释的抗TGF－β1的Ⅰ抗，置于4 ℃孵育过夜。用含0.1%吐温－20 的TBST 缓冲液(TBS/T)洗膜3 次，每次5 min。然后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，以1∶2 500 稀释，室温孵育90 min，TBS/T 洗膜3 次，每次5 min。最后采用增强化学发光法(ECL)显影，扫描检测蛋白表达状况。用Smartview 软件分析目标条带灰度值，与内参照actin 条带灰度值校正后进行半定量分析。

3 统计学处理

结 果

1 Sr 增加rBMSCs ALP 活性

图1 显示，应用0. 1 ～7 mmol/L Sr 分别处理rBMSC 7 d，均能明显增加ALP 活性，与对照组比较，差异均有统计学意义(均P ＜0.05)。其中3 mmol/L Sr 对ALP 活性的促进作用最大。

Figure 1. Effects of strontium ranelate (Sr)at different concentrations on activity of ALP in BMSCs of rats. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control.图1 不同浓度Sr 对rBMSCs ALP 活性的影响

2 Sr 促进rBMSCs 的钙结节形成

图2 显示，3 mmol/L Sr 处理rBMSCs 21 d，可明显地增加钙结节的数量及面积。

3 Sr 对rBMSCs TGF－β1 表达的影响

图3A 显示，应用0.1 ～5 mmol/L Sr 处理rBMSCs 7 d 均可明显上调TGF－β1表达，其中1 mmol/L Sr 对TGF－β1表达的上调作用最大，TGF－β1表达是对照组的3.1 倍(P ＜0.01)。但是，7 mmol/L Sr对TGF－β1表达无明显作用(P ＞0.05)。图3B 显示，在应用1 mmol/L Sr 处理rBMSCs 1 ～7 d，Sr 呈时间依赖性地上调TGF－β1表达，其中处理细胞7 d 时，TGF－β1的表达水平达到最高峰。然而，1 mmol/L Sr 处理rBMSCs 10 d 时对TGF－β1表达无明显影响。

Figure 3. Effects of Sr on expression of TGF－β1 in BMSCs.A:rBMSCs were treated with Sr at 0.1 to 7 mmol/L for 7 d;B:rBMSCs were treated with 1mmol/L Sr for 1 to 7 d. ±s.n=6. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control.图3 Sr 对rBMSCs TGF－β1 表达的影响

4 TGF－β1 抑制剂拮抗Sr 对TGF－β1 表达的上调作用

图4 显示，应用1 mmol/L Sr 处理rBMSCs 7 d 可明显上调TGF－β1的表达(P ＜0.01);在Sr 处理细胞前2 h，应用10 μmol/L SB431542(TGF－β1抑制剂)预处理细胞可显著地阻断Sr 对TGF－β1表达的上调作用;10 μmol/L SB431542 或DMSO 对TGF－β1的基础表达水平无明显影响。

5 TGF－β1 抑制剂拮抗Sr 对ALP 活性的促进作用

图5 显示，应用1 mmol/L Sr 处理rBMSCs 7 d 可明显增加ALP 活性，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05);在Sr 处理细胞前2 h，用10 μmol/L SB431542(TGF－β1抑制剂)预处理细胞可明显地抑制Sr 对ALP 活性的促进作用，与Sr 处理组比较，差异显著(P ＜0.05)。10 μmol/L SB431542 或DMSO对ALP 活性无明显的作用。

Figure 4. SB431542(inhibitor of TGF－β1，10 μmol/L)preconditioning inhibited Sr－induced overexpression of TGF－β1 in rBMSCs.Sr:rBMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 7 d;Sr+SB431542:rBMSCs were pretreated with SB431542 for 2 h，followed by the treatment with Sr(1 mmol/L)for 7 d;SB431542:rBMSCs were treated with SB431542 for 2 h and then with DMSO for 7 d;DMSO:rBMSCs were cultured with DMSO for 7 d. ±s.n=5. ##P ＜0.01 vs control;＊＊P ＜0.01 vs Sr.图4 TGF－β1 抑制剂阻断Sr 对rBMSCs TGF－β1 表达的上调作用

Figure 5. Preconditioning with SB431542(10 μmol/L)inhibited Sr－induced activity enhancement of ALP in BMSCs.Sr:rBMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 7 d;Sr+SB431542:rBMSCs were pretreated with SB431542 for 2 h，followed by the treatment with Sr(1 mmol/L)for 7 d;SB431542: rBMSCs were treated with SB431542 for 2 h and then with vechicle for 7 d;DMSO:rBMSCs were cultured by DMSO for 7 d. ±s.n=5. #P ＜0.05 vs control;* P ＜0.05 vs Sr.图5 TGF－β1 抑制剂阻断Sr 对ALP 活性的增强作用

6 TGF－β1 抑制剂阻断Sr 对钙结节形成的促进作用

图6 显示，1 mmol/L Sr 处理rBMSCs 21 d 可显著的增加钙结节的数量;在Sr 处理细胞前2 h，应用TGF－β1抑制剂SB431542(10 μmol/L)预处理细胞能明显地抑制Sr 对钙结节形成的促进作用;10 μmol/L SB431542 或DMSO 本身对钙结节数量无明显影响。

讨 论

Figure 6. Preconditioning with SB431542(10 μmol/L)inhibited Sr－induced mineralization in BMSCs(alizarin red staining，×100).A:control;B:rBMSCs were treated with 1 mmol/L Sr for 21 d;C:rBMSCs were pretreated with SB431542 for 2 h，followed by the treatment with Sr(1 mmol/L);D:rBMSCs were treated with SB431542 for 2 h and then with DMSO for 21 d;D:rBMSCs were cultured by DMSO for 21 d.图6 TGF－β1 抑制剂(SB431542)对钙结节形成的影响

ALP 是细胞成骨分化的一个早期指标，是调节细胞矿化的重要酶之一。本研究采用ALP 及钙结节形成作为判断rBMSCs 向成骨细胞分化的指标。研究结果表明，新型的抗骨质疏松剂Sr 能明显的增加rBMSCs 的ALP 活性及钙结节数量，提示Sr 具有促进rBMSCs 向成骨细胞分化的作用，这与文献报道［1，4－5，9－11］的结果一致。TGF－β1属于转化生长因子β(TGF－β)超家族成员之一，它是一个分泌型多肽信号分子，生物活性极其广泛，能调控多种间充质来源的细胞增殖和定向分化、尤其是在细胞成骨分化、骨基质合成和骨重建中起着重要的作用，是调控rBMSCs 的首选生长因子之一［10，12］。TGF－β1也是人类骨骼中含量最丰富的生长因子，通过影响rBMSCs 向成骨细胞方向的转化而影响正常及病理下的骨骼形态［13］。已有研究表明，TGF－β1可能在锶促进rBMSCs 向成骨细胞分化的过程中起着重要的作用［9］。但是，TGF－β1在Sr促进rBMSCs 向成骨细胞分化中的作用如何迄今未见报道。根据本研究得出的结果，我们推测TGF－β1可能参与Sr 促进rBMSCs 向成骨细胞分化的过程。本研究在应用Sr 处理rBMSCs 前，用TGF－β1特异性抑制剂SB431542 预处理细胞，结果表明，TGF－β1抑制剂不仅能阻断Sr 对rBMSCs TGF－β1表达的上调作用，而且能抑制Sr 对ALP 活性及钙结节形成的促进作用，提示通过上调TGF－β1表达可能是Sr 促进rBMSCs 向成骨细胞分化的重要作用机制之一。

然而，对于TGF－β1在调节成骨中的作用有不同的意见。Shingo 等［14］认为，TGF－β1对于骨形成具有促进和抑制的双重作用［11］。TGF－β1也能促进rBMSCs 的迁移，具有促进骨形成和骨吸收的双重作用［15］。但是，Zhao 等［7］却观察到TGF－β1可促进鼠类BMSCs 的成骨分化，表现在它能增加Runx2、OPN 及Col I mRNA 表达及ALP 活性。因此，有关TGF－β1在促进rBMSCs 向成骨细胞分化中的作用仍需作进一步的探讨。

综上所述，本研究证实Sr 可促进rBMSCs 向成骨细胞分化，此作用可能与其上调TGF－β1表达有关。本文为深入阐明Sr 的促成骨机制提供了实验依据。

［1］ Bonnelye E，Chabadel A，Saltel F，et al. Dual effect of strontium ranelate:stimulation of osteoblast differentiation and inhibition of osteoclast formation and resorption in vitro［J］.Bone，2008，42(1):129－138.

［2］ Seeman E，Vellas B，Benhamou C，et al.Strontium ranelate reduces the risk of vertebral and nonvertebral fractures in women eighty years of age and older［J］. J Bone Miner Res，2006，21(7):1113－1120.

［3］ Caverzasio J，Thouverey C. Activation of FGF receptors is a new mechanism by which strontium ranelate induces osteoblastic cell growth［J］. Cell Physiol Biochem，2011，27(3－4):243－250.

［4］ 廖清船，肖洲生，秦艳芳，等.p44/42 和p38 MAPK 在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中发挥不同的功能［J］.中国骨质疏松杂志，2004，10(3):267－271.

［5］ Peng S，Zhou G，Luk KD，et al.Strontium promotes osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells through the ras/MAPK signaling pathway［J］. Cell Physiol Biochem，2009，23(1－3):165－174.

［6］ Tachi K，Takami M，Sato H，et al. Enhancement of bone morphogenetic protein－2－induced ectopic bone formation by transforming growth factor－β1［J］. Tissue Eng Part A，2011，17(5－6):597－606.

［7］ Zhao L，Jiang S，Hantash BM，et al. Transforming growth factor β1induces osteogenic differentiation of murine bone marrow stromal Cells［J］. Tissue Eng Part A，2010，16(2):725－733.

［8］ 张丽蓉，夏文杰，项 鹏，等.体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的研究［J］，中国病理生理杂志，2002，18(7):745－748.

［9］ Lee KS，Kim HJ，Li QL，et al.Runx2 is a common target of transforming growth factor β1and bone morphogenetic protein 2，and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast－specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12［J］. Mol Cell Biol，2000，20(23):8783－8792.

［10］ Kim MK，Niyibizic. Znteraction of TGF－β1and rhBMP2 on human bone marrow stromal cells cultured in collagen gel matrix［J］.Yonsei Med J，2001，42(3):338－344.

［11］ Sila－Asna M，Bunyaratvej A，Maeda S，et al. Osteoblast differentiation and bone formation gene expression in strontium－inducing bone marrow mesenchymal stem cell［J］.Kobe J Med Sci，2007，53(1－2):25－35.

［12］ 潘海涛，郑启新，郭晓冬，等.兔骨髓基质干细胞的分离培养和鉴定及转化生长因子β1的基因瞬时转染研究［J］.医学研究生通报，2006，19(6):508－511.

［13］ Kanaan RA，Kanaan LA. Transforming growth factor beta1，bone connection［J］. Med Sci Monit，2006，12(8):RA164－RA169.

［14］ Shingo Maeda，Makoto Hayashi，Setsuro Komiya，et al.Endogenous TGF－β1signaling supresses maturation of osteoblastic mesenchymal cells［J］.EMBO J，2004，23(3):552－563.

［15］ Tang Y，Wu X，Lei W. TGF－β1－induced migration of bone mesenchymal stem cells couples bone resorption and formation［J］.Nat Med，2009，15(7):757－765.