类风湿性关节炎患者caspase-7β亚型基因的多态性分析*

江雨霏， 沈 波， 金 翔， 陈佳喜， 朱 敏

(温州医学院附属浙江省台州医院检验科，浙江 台州 317000)

类风湿性关节炎患者caspase-7β亚型基因的多态性分析*

江雨霏， 沈 波△， 金 翔， 陈佳喜， 朱 敏

(温州医学院附属浙江省台州医院检验科，浙江 台州 317000)

目的： 探讨中国台州地区caspase-7 β亚型基因rs2227309多态性与类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)易感性的关系。方法对204位类风湿性关节炎患者与203位健康体检者进行研究，采用荧光定量单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析的方法对caspase-7 β亚型基因rs2227309多态性进行检测。结果RA患病组中GG、AG、AA基因型频率分别为33.3%、53.4%、13.2%，健康对照组中GG、AG、AA基因型频率分别为33.0%、44.3%、22.7%。RA患者组与健康对照组相比，caspase-7 β亚型基因rs2223709基因型分布的差异显著(Plt;0.05)。RA患病组GG+AG基因型频率高于健康对照组，差异显著(Plt;0.05，OR=1.921，95%CI为1.140～3.236)。RA患者组与健康对照组中G等位基因频率分别为60.0%与55.2%。RA患者组与健康对照组相比，等位基因分布的差异不显著(Pgt;0.05，OR=1.221，95%CI为0.924～1.613)。结论Caspase-7 β亚型基因rs2227309可能与中国台州地区人群类风湿性关节炎易感性有关，这种关系可能是由于caspase-7非功能亚型转录水平相对升高致使滑膜细胞凋亡活性减弱所致。

Caspase-7 β亚型； 基因多态性； 关节炎，类风湿性

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，最终残废。RA的发病机制尚未完全明确[1]，但已发现其发病与环境、细胞、病毒、遗传、性激素及神经精神状态等因素有关，特别是与滑膜细胞凋亡减弱密切相关[2]。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteases, caspases)是一组在细胞凋亡过程中起关键作用的酶[3]，可能与RA易感性有关。但RA患者接受不同药物治疗，凋亡相关蛋白的检测容易受到其影响而出现干扰性差异。于是本研究拟通过检测调查人群中caspase-7 β亚型基因rs2227309 (G/A)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，探讨中国台州地区汉族人群caspase-7 β亚型基因多态性与RA易感性的相关性，从而为探索RA的发病机制提供参考依据。

材 料 和 方 法

1对象

实验分RA患病组与健康对照组。(1) RA患病组：RA患者204例，选取2009年1月至2010年11月在浙江省台州医院就诊的患者，其中男50例，女154例，年龄20～82岁，平均年龄(51.6±11.5)岁。诊断均符合美国风湿病协会1987年修订的RA分类诊断标准。(2) 健康对照组：选取2010年11月至12月在浙江省台州医院体检中心检查的健康者203例，无关节畸形，排除各种全身性炎症疾病。其中男49例，女154例，年龄22～86岁，平均年龄(51.8±10.1)岁。以上研究对象均在知情同意的情形下取得。全部研究对象均来自台州地区汉族人群，且无亲缘关系。

2主要试剂

人全血基因组DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司，TaqMan® 荧光定量SNP分析探针以及PCR mix均购自Applied Biosystems。仪器使用Applied Biosystems公司的StepOnePlusTMReal-Time PCR System。

3方法

3.1标本收集与保存 空腹抽取研究对象静脉血2 mL并以EDTA抗凝，-80 ℃冰箱保存备用。

3.2白细胞基因组DNA抽提 取上述抗凝血500 μL，按照全血基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行，-80 ℃冰箱保存备用。

3.3Caspase-7基因型鉴定应用 使用Applied Biosystems公司的TaqMan®荧光定量SNP分析探针(TaqMan® SNP Genotyping Assays)，探针的荧光染料分别为绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein, VIC)与羧基荧光素(carboxyfluorescein, FAM)，其检测的具体序列如图1，VIC标记的探针检测A等位基因，FAM标记的探针检测G等位基因。总反应体系为20 μL，选用96孔板，每板设置1个阴性对照，每个标本检测2次，若2次结果存在差异，或者其中1次结果模糊不清，则进行复查。严格按照试剂说明书进行操作，预变性95 ℃ 10 min，随后进行40个循环(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)。

Figure 1. Caspase-7 rs2227309 gene sequences.

图1Caspase-7rs2227309基因序列

4统计学处理

数据处理应用SPSS 17.0软件包完成。RA患病组与健康对照组之间性别比对检验采用2检验，年龄比对检验采用成组t检验。基因型频率采用累积计算法求得，Hardy-Weinberg平衡检验采用2检验。由基因型频率直接计算等位基因频率，组间基因型及等位基因频率比较采用2检验。

结 果

1RA患者组和健康对照组基本特征

如表1所示，RA患者组与健康对照组年龄和性别无显著差异。RA患者组病程为(10.1±8.2) 年，血清类风湿因子(rheumatoid factor，RF)和抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)抗体阳性率分别为84.8%和92.6%；健康对照组未检出上述RA相关血清因子。

表1 实验对象的临床资料及分组信息

2Hardy-Weinberg平衡检验

3RA患者组和健康对照组基因型频率和等位基因频率分布比较

表2显示，RA患者组的GG与GA基因型总和高于健康对照组，Plt;0.05，差异显著。

表3显示，RA患者组等位基因G的比例略高于健康对照组，Pgt;0.05，差异不显著。

表2 RA与健康对照组caspase-7 rs2227309基因型相对危险度分析

表3 RA与健康对照组caspase-7 rs2227309等位基因相对危险度分析

讨 论

RA是一种病因学尚未完全明了的慢性炎症性自身免疫性疾病，其主要特征为持续性滑膜组织炎症和渐进性关节破坏。即滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，最终残废。RA是最常见的风湿性疾病之一，分布于所有的种族和民族，可发生于任何年龄段，但随着年龄的增加其发病率呈上升趋势。患者男女比例通常为1∶3。

本病的病因尚未完全明确，一般认为，RA是具有遗传倾向的易感人群在受到未知抗原刺激后所产生的自身免疫反应性疾病，发病与环境、细胞、病毒、遗传、性激素及神经精神状态等多种因素有关[4]。目前研究显示，成骨细胞增生与滑膜巨噬细胞、成纤维细胞和淋巴细胞凋亡减弱的不平衡可能是导致RA持续发展的一个机制。RA患者成骨细胞的凋亡增加可能致关节周围骨损害，而类风湿滑膜细胞的凋亡削弱似乎导致滑膜组织增生[2]。并且，动物研究表明，在关节炎模型中，诱导滑膜细胞凋亡的增加，改善了滑膜组织的增生[5-6]。

Caspases是一类进化上高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡过程中起关键作用。Caspase与多数蛋白酶一样在胞内以无活性的酶原形式存在，酶原由N-端前结构域(prodomain)、大约20 kD的大亚基(p20)和大约10 kD的小亚基(p10)3部分组成。成熟caspases酶蛋白都须通过水解prodomain序列，分别由2个p20亚基和2个p10亚基进行组装，从而激活[7]。活化的caspase可水解底物,并通过级联放大诱发凋亡。目前已发现的caspases有14种, 分为炎症caspases、启动子caspases和效应子caspases 3类[8]。根据起始激活的caspase不同，凋亡激活途径分为3种，而最终都导致效应子caspases(caspase-3、caspase-6和caspase-7)的反应，引起细胞凋亡[9]。

大鼠实验表明，缺乏caspase-7会导致凋亡减弱[10]。基于caspase-7在凋亡中的作用，它可能是自身免疫性疾病易感性的影响因素之一。但是由于RA患者接受不同药物的治疗，并且许多治疗可能影响到凋亡途径，因此直接检测caspase-7蛋白表达容易受其影响。而caspase-7基因定位于10q25.1-10q25.2，已经发现其相邻区域10q21和10q26与RA的易感性有关[11]，于是近年来出现针对caspase-7基因多态性与RA易感性的研究。

本实验中, 健康对照组人群中rs2227309位点上AA基因型者占全组人群的22.7%，AG基因型者占全组人群的44.3%，GG基因型者占全组人群的33.0%，基本符合此前研究公布的基因频率。RA患病组中，AA基因型患者占全组人群的13.2%，AG基因型患者占全组人群的53.4%，GG基因型患者占全组人群的33.3%。RA患病组AG+GG基因型含量相对较高，差异具有统计学意义。进而分析其等位基因，健康对照组人群中A等位基因占44.8%，G等位基因占55.2%；RA患者组A等位基因占40.0%，G等位基因占60.0%。RA患者组G等位基因的频率较健康对照组略高，但差异不显著。我们可以假设RA患者组AG基因型与GG基因型的比例均高于健康对照组，所以基因型差异比较显著，而RA患者G等位基因的增高并不明显。

我们发现GG基因型与AG基因型合并组的危险度最高(OR=1.921，95%CI:1.140～3.236，Plt;0.05)。而AG基因型频率OR=1.441，GG基因型频率OR=1.015，即AG基因型与RA易感性的关系更加显著。这也可以解释RA患者单独G等位基因的增高并不显著。我们推测，caspase-7 rs2227309基因位点GG+AG基因型频率与RA的易感性有关。

如今已经发现，通过对caspase-7基因转录产物进行不同剪切拼接可以产生4种mRNA，编码3种不同的caspase-7亚型。其中最大的亚型为δ亚型，由mRNA的δ型(又称为α’型)编码。Caspase-7 α亚型是一个有303个氨基酸残基的多肽链，属于功能亚型，参与促进细胞凋亡的过程，由mRNA的α型或γ型编码。此外，caspase-7 β亚型是其最小的亚型，由253个氨基酸残基组成，它与α亚型的C端序列不同，缺乏酶的活性位点，可能作为主要的caspase-7活性形式抑制剂，由mRNA的β型编码[12-13]。Caspase-7 rs2227309编码定位于蛋白的C-末端，对非β亚型无影响，在β亚型产生K249R的改变[14]。既往研究表明，其改变可能引起caspase-7 β亚型mRNA的相对表达量升高[15-16]，从而导致凋亡减弱，滑膜细胞增生，参与RA的发病。

综上所述，在RA患者组与健康对照组中，caspase-7 β亚型基因rs2227309基因型分布具有差异，这可能是通过引起caspase-7非功能亚基的相对表达量升高，而导致滑膜细胞凋亡减弱，参与RA的发病。目前国内尚无caspase-7基因多态性与RA的相关性研究。我们可以通过进一步检测中国地区RA患病者caspase-7 β亚基的含量进而探讨其在RA发病中的作用。同时，我们也可以通过检测caspase-7在凋亡通路中上游或者下游分子成分的改变，明确凋亡对于RA发病的具体作用。从而为探讨RA的发病机制，对其进行早期预防、早期诊断、早期治疗提供新的思路。

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Geneticpolymorphismofcaspase-7isoformβinpatientswithrheumatoidarthritis

JIANG Yu-fei, SHEN Bo, JIN Xiang, CHEN jia-xi, ZHU Min

(DepartmentofClinicalLaboratory,TaizhouHospital,WenzhouMedicalCollege,Taizhou317000,China.E-mail:shenbkz@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the association between the rs2227309 polymorphism of cysteinyl aspartate-specific protease-7 (caspase-7) isoform β and the genetic susceptibility in rheumatoid arthritis (RA) patients in Taizhou of China.METHODSGenotyping of rs2227309 of caspase-7 isoform β gene was performed in 204 RA patients and 203 matched healthy controls using TaqMan single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assays.RESULTSThe genotype frequencies of GG, AG and AA of caspase-7 polymorphism in the RA patients were 33.3%, 53.4% and 13.2%, respectively, and 33.0%, 44.3% and 22.7% in the healthy individuals,respectively. There was a significant difference in caspase-7 genotype frequencies between the RA patients and healthy controls (Plt;0.05). The frequency of GG+AG genotype in RA patients was higher than that in healthy controls with significant difference (Plt;0.05, OR=1.921, 95%CI: 1.140～3.236). The frequencies of the G allele were 60.0% and 55.2% in the RA patients and the healthy individuals,respectively. No significant difference was observed in allele frequency between the RA patients and healthy controls (Pgt;0.05, OR=1.221, 95%CI: 0.924～1.613).CONCLUSIONThe rs2227309 polymorphism of caspase-7 isoform β gene is associated with the susceptibility to rheumatoid arthritis. The high production of the non-functional variant of caspase-7 may reduce the apoptosis of rheumatoid synovial cells, indicating the mechanism of this association.

Caspase-7 isoform β; Genetic polymorphism; Arthritis,rheumatoid

1000-4718(2011)12-2368-04

R593.22

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.12.024

2011-08-10

2011-10-13

浙江省科技厅公益技术社会发展项目(No.2010C33001)；台州市科技计划(No.102KY09)

△通讯作者 Tel: 0576-85199345 ; E-mail：shenbkz@yahoo.com.cn